Zebrabalığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Tonu
Summary
Lazer ablasyon biyolojik sistemlerde rejenerasyon eğitimi için yaygın olarak uygulanan bir teknolojidir. Sunulan protokol, lazer ablasyon için standart bir lazer tarama konfokal mikroskobu ve zebrabalığı lateral hattında ki internöromast hücrelerinin yenilenmesinin daha sonra zaman atlamalı görüntülemesini açıklar.
Abstract
Saç hücreleri işitme duyusuna aracılık eden mechanosensory hücrelerdir. Bu hücreler insanlarda hasar sonra yenilenmez, ancak doğal olarak zebra balığı gibi memeli olmayan omurgalılarda yenilenir. Zebra balığı lateral çizgi sistemi duyusal saç hücresi rejenerasyonu karakterize etmek için yararlı bir modeldir. Lateral çizgi nöromastlar denilen saç hücresi içeren organlardan oluşur, internöromast hücrelerinin bir dizi ile birbirine bağlı olan (INMCs). INMCs geliştirme sırasında yeni nöromastlar neden progenitor hücreleri olarak hareket. INMC’ler hücre ölümü yle oluşturulan lateral hat sistemindeki boşlukları onarabilir. İnM’lerde yeşil floresan proteini ifade eden geleneksel lazer taramalı konfokal mikroskop ve transgenik balık kullanılarak selektif INMC ablasyon için bir yöntem tanımlanmıştır. Daha sonra INMC rejenerasyonunun izlenmesi ve boşluk kapatma oranının belirlenmesi için hızlandırılmış mikroskopi kullanılır. Bu, yüksek güçlü darbeli ultraviyole lazer gibi özel ekipman gerektirmeyen hücre ablasyon için erişilebilir bir protokolü temsil eder. Ablasyon protokolü, birçok kullanıcı tarafından zaten kullanılabilen bir araç kümesini çalıştırarak ek hücre türlerinin ablasyonu için yararlı olabileceğinden, daha geniş ilgi alanlarına hizmet edebilir. Bu teknik, inmc rejenerasyonunun farklı koşullar altında ve farklı genetik geçmişlere sahip karakterizasyonunun daha da olanak sağlayacaktır, bu da duyusal progenitor hücre yenilenmesi nin anlaşılmasını sağlayacaktır.
Introduction
En ilerici işitme kaybı özünde duyusal saç hücrelerinin imha yatıyor, hangi sinir uyarıları içine dışsal işitsel uyaranları beyin tarafından tespit transduce. Koklear saç hücresi ölümü kalıcı işitme kaybına neden olur, yetişkin memeliler hasar sonrasında bu hücreleri yeniden yeteneği yoksun olarak. Tersine, zebra balığı gibi memeli olmayan omurgalılar akustik travma veya ototoksik hakaret kayıp saç hücrelerini yenileyebilir. Zebrabalığı mekanosensory lateral line saç hücresi rejenerasyon çalışması için kullanılabilecek basit ve kolay manipüle organ sistemi1,2,3.
Lateral çizgi nöromastlar denilen küçük duyusal yamalar oluşur, internöromast hücreleri olarak bilinen uzatılmış hücrelerin bir dizi ile geliştirme sırasında bağlı olan (INMCs). Yeni saç hücre içeren organlara yol açan görünür kök hücreler olarak proliferatif kapasitegöz önüne alındığında, INMCs davranışı toplum için büyük ilgi olduğunu4,5. INMCs ile ilgili araştırmaların çoğu lateral line sinir etrafında sarmak yakındaki Schwann hücreleri tarafından proliferasyon bastırma karakterize dir, Wnt bir inhibitörü ile büyük olasılıkla / β-catenin sinyal. 6,7,8. INMC proliferasyonunun düzenlenmesi ve yeni nöromastlara farklılaşma iyi tanımlanmış olsa da, ablasyon sonrası INMC’nin yeniden büyümesini yöneten mekanizmalar açıklığa kavuşturulamamıştır. Bu protokol, bireysel INMC’leri ablating ve sonraki rejeneratif davranışlarını analiz bir araç olarak hizmet vermektedir.
Saç hücrelerini yok etmek için çeşitli yöntemler, hücreleri destekleyen, ve tüm nöromastlar, kurtarma izleme metodolojileri ile birlikte yayınlanmıştır. Kimyasal ablasyon saç hücreleri için iyi çalışır, ancakCuSO gibi toksik kimyasalların dozları 4 önemli ölçüde diğer lateral hat hücre tipleri kaldırmak için artırılmalıdır9. Floresan mikroskopi altında elektroablasyon rejenerasyon çalışma INMCs yok etkili ve basit bir araç olmakla birlikte, dar hedef zordur ve bu nedenle, önemli teminat hasar üretmek olasıdır. Sonuç olarak, bu INMC’ye özgü davranışların yönlerini maskeleyebilir10,11. Lazer ablasyon protokolleri istihdam edilmiştir, ancak mutlaka ortalama laboratuvar veya görüntüleme tesisinde mevcut özel ekipman kullanımını gerektirir (yani, yüksek güçlü darbeli UV lazerler12). Burada açıklanan yöntem, genellikle DAPI ve diğer mavi floroforların görüntülenmesinde kullanılan ortak 405 nm lazer ile donatılmış herhangi bir lazer tarama lı konfokal mikroskop ile yapılabilir. Bu yöntemin bir avantajı, ek lazer kontrol sistemleri ne olursa olsun veya darbeli lazer ile donatılmış başka bir mikroskoba aktarılmadan hücre hasarından hemen önce ve sonra konfokal görüntüleme nin yapAbilmeleridir.
Benzer bir yöntem zebrabalığı omurilik13nörting nöronlar için tarif edilmiştir. Ancak, önceki yöntem hücre ablasyon için bir FRAP modülü gerektirir, bu protokol için bir gereklilik değildir. Ayrıca, farklı hücre tiplerinin farklı özellikleri (yani transgen floresansının parlaklığı, vücut içindeki derinlik ve hücre şekli) göz önüne alındığında, kullanılan hücre tipine bağlı olarak önemli değişikliklere ihtiyaç duyulması olasıdır. Burada ayrıntılı protokol daha yüzeysel hücreler için etkili olması muhtemeldir, aynı yöntemi kullanarak duyusal saç hücresi ablasyon bir gösteri tarafından desteklenen gibi. Ayrıca ablasyon sonrası INMC kurtarma oranlarını değerlendirmek için bir rejenerasyon tofman, yukarıda belirtilen çalışmanın bir özelliği değildi.
Burada ayrıntılı olarak yer alan lazer tabanlı hücre ablasyon protokolü, lazer koşullarının optimizasyonu, ablasyon öncesi ve sonrası görüntüleme ve hızlandırılmış mikroskopi yoluyla INMC’lerin rejeneratif kapasitesini yakalar. Bu unsurlar, INMC’nin yeniden büyümesini ve boşluğu tamamen kapatmayı kapsamlı bir şekilde tasvir etmek için bir araya gelirler. Bu protokol burada INMC’leri yok etmek için kullanılırken, hücresel ablasyonun güvenilir ve etkili bir şekilde değerlendirilmesi gerektiren diğer işlere de uygulanabilir. 405 nm lazer ile donatılmış herhangi bir konfokal mikroskop üzerinde yapılabilir, çünkü aynı zamanda erişilebilir bir teknolojidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol, yakın ultraviyole lazer (405 nm dalga boyu) ile donatılmış herhangi bir konfokal mikroskobun üzerinde yapIlebilen lazer hücre ablasyon için çok yönlü bir yöntemi açıklamaktadır. Bu protokol, elektroablasyon (daha yaygın hasara neden olan11)ve darbeli UV-lazer ablasyon (ek özel ekipman12gerektirir) gibi daha önce kullanılan yöntemlerin sınırlamalarını gideriyor. Ablasyon öncesi ve sonrası konfokal görüntüleme, deneyin başarısı ile ilgili hızlı geri bildirim sağlar. Sonraki hızlandırılmış mikroskopi duyusal sistem gelişimi için kritik bir hücre tipinde rejenerasyon için basit bir tarar sunuyor.
Nöromastlarda ve INMC’lerde GFP’yi güçlü bir şekilde ifade eden transgenik zebra balıklarının ön ekran alabilmeleri hayati önem taşımaktadır. Parlak floresan ve primI kaynaklı nöromastların yaklaşık olarak eşit aralıklı larvaları lazer ablasyon için ideal adaylardır. Bu balıklarda bile, ilk tespitten kaçabilecek dimmer INMC’ler vardır. Bu hücreler lazer ablasyon dan sonra geride kalabilir, INMC’ler arasında gerçek bir boşluk oluşumunu engelleyerek. Dijital kazanç, 405 nm lazer (adım 8.2) ile de hedeflenebilir şekilde ablasyon öncesi görüntüleme sırasında bu dimmer hücreleri ortaya çıkarmak için ayarlanmalıdır.
Benzer şekilde, lazer hedefleme bazen tamamen bir hücre yok olmaz; bunun yerine, gerçek bir boşluk oluşturmak için bir başarısızlık ile sonuçlanan, floresan ağartmak olacaktır. Bu hücreler genellikle timelapse mikroskopi sırasında floresan artacaktır. T-PMT görüntüleme(Şekil 2)ile birlikte ablasyon sonrası görüntüleme adımında kazanım ayarlaması, hedeflenen tüm hücrelerin etkin bir şekilde çıkarılmasını sağlamaya yardımcı olur. INMC dizesinde bir boşluk oluşturmak için sık sık iki veya üç ayrı hücre ablasyonları gerektirir. Hücre ölümü, hedeflenen hücrelerde kanama veya tanecikgörünümü ile saptamak olabilir; rağmen, bu lazer hedefleme sonra kısa bir bekleme süresi gerektirebilir (ve bazı durumlarda, belirgin apoptotik veya nekrotik rakamlar kısa bir süre sonra gözlenir).
Bu prosedürün bir sınırlama lazer koşulları optimize edilmeden ve INMC rejenerasyon başarılı önce birden fazla deneysel çalışmalar gerektirebilir olmasıdır. Lazer gücü ve lazerin toplam çalışma süresi, her biri farklı numuneler için hafif bir ayarlama gerektirebilir. Bu aşırı lazer uygulaması kendini onarmak için lateral hattın yeteneğini bozabilir bulunmuştur. Bu hem içerir 1) lazer ışınlama için bireysel hücrelerin aşırı pozlama, muhtemelen çevre dokulara ek hasara neden, yanı sıra 2) dize çok fazla hücre ablasyon, daha büyük bir boşluk yol açan. Kullanıcılar, yıkımlarını sağlamak için yeterli derecede ışınlanan hücreler arasında bir denge sağlamalıdır ve hücreleri aşırı maruz bırakmamalıdır, bu da yenilenmeyi yavaşlatabilir veya önleyebilir. Uygun ayarlarla, INMC’lerin arka lateral line sinirde gözle görülür bir hasar olmadan çıkarılabildiği tespit edilmiştir, bu da elektroablasyonun aksine bu protokol ile ikincil hasarın en aza indirildiğini gösterir11. Hiçbir durumda gözlenen boşluk ta yeni nöromastlar oluşan vardı, muhtemelen lateral çizgi sinir bozulmadan kalır ve altta yatan glial hücreler kalır ve INMCs yayılmasını inhibe çünkü6,7,8,11.
Bu konfokal lazer ablasyon yönteminin diğer hücre tiplerine de uygulanabileceği gösterilmiştir, özellikle de duyusal saç hücreleri de dahil olmak üzere hayvanın içinde yüzeysel olarak bulunanlarda(Şekil 4). Benzer bir protokol daha önce açıklandığı gibi, yara onarım veya aksonal rejenerasyon çalışmaları için nöronlar incelemek için cilt hücreleri ablate için kullanılabilir13. Bu tekniğin konfokal mikroskoba sahip ancak lazer ablasyon için başka özel ekipman alabilen laboratuvarların deneysel repertoisine yararlı bir katkı olacağı tahmin edilmektedir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH R15 hibe 1R15DC015352-01A1 ve Pace Üniversitesi iç finansman kaynakları tarafından finanse edilmiştir. Balık hatları Vladimir Korzh14nezaket edildi , Katie Kindt15,16, ve A. James Hudspeth laboratuvar. A. James Hudspeth’e ve grubu üyelerine bu deneyler hakkında geri bildirimde bulunurken, Pace Üniversitesi’ndeki meslektaşlarına desteklerinden dolayı teşekkür ederiz. RStudio’daki lojistik regresyon analizi özellikle meslektaşımız Matthew Aiello-Lammens tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 12-well PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Sciences | 63425-05 | |
| 15 mM Tricaine stock solution | Sigma | E10521 | 15 mM Tricaine in reverse osmosis water |
| 1X E3 + 600 µM Tricaine | Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media | ||
| 1X E3 media | Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L) | ||
| 60 X E3 media | All components purchased from Sigma-Aldrich | 34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water | |
| Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence | Olympus | ||
| LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers | Carl Zeiss Microscopy, LLC | A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40 | |
| FIJI/ImageJ Image processing software | Multiple contributors | Downloadable at https://fiji.sc/ | |
| Dissecting needle modified into hair knife | Fisher Scientific | 19010 | An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle |
| Microsoft Excel software | Microsoft Corp. | Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel | |
| Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window | Mattek Corporation | P35G-1.5-20-C | 35 mm petri dish, 20 mm glass window |
| Immersol 518F Immersion Oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Low Gelling Agarose | Sigma Life Science | A9414-256 | |
| Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert | Millipore Sigma | CLS3479-48EA | |
| Rstudio software | Rstudio PBC | Downloadable at https://rstudio.com/ | |
| SMX-168-BL Stereo microscope | Motic | ||
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| ZEN software | Carl Zeiss Microscopy, LLC |
References
- Denans, N., Baek, S., Piotrowski, T. Comparing Sensory Organs to Define the Path for Hair Cell Regeneration. Annual Review Cell & Developmental Biology. 35, 567-589 (2019).
- Ghysen, A., Dambly-Chaudiere, C. The lateral line microcosmos. Genes & Development. 21 (17), 2118-2130 (2007).
- Lush, M. E., Piotrowski, T. Sensory hair cell regeneration in the zebrafish lateral line. Dev Dyn. 243 (10), 1187-1202 (2014).
- Ledent, V. Postembryonic development of the posterior lateral line in zebrafish. Development. 129 (3), 597-604 (2002).
- Nunez, V. A., et al. Postembryonic development of the posterior lateral line in the zebrafish. Evolution and Development. 11 (4), 391-404 (2009).
- Grant, K. A., Raible, D. W., Piotrowski, T. Regulation of latent sensory hair cell precursors by glia in the zebrafish lateral line. Neuron. 45 (1), 69-80 (2005).
- Lopez-Schier, H., Hudspeth, A. J. Supernumerary neuromasts in the posterior lateral line of zebrafish lacking peripheral glia. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 102 (5), 1496-1501 (2005).
- Lush, M. E., Piotrowski, T. ErbB expressing Schwann cells control lateral line progenitor cells via non-cell-autonomous regulation of Wnt/beta-catenin. eLife. 3, 01832 (2014).
- Hernandez, P. P., et al. Sublethal concentrations of waterborne copper induce cellular stress and cell death in zebrafish embryos and larvae. Biological Research. 44 (1), 7-15 (2011).
- Moya-Diaz, J., et al. Electroablation: a method for neurectomy and localized tissue injury. BMC Developmental Biology. 14, 7 (2014).
- Sanchez, M., Ceci, M. L., Gutierrez, D., Anguita-Salinas, C., Allende, M. L. Mechanosensory organ regeneration in zebrafish depends on a population of multipotent progenitor cells kept latent by Schwann cells. BMC Biology. 14, 27 (2016).
- Viader-Llargues, O., Lupperger, V., Pola-Morell, L., Marr, C., Lopez-Schier, H. Live cell-lineage tracing and machine learning reveal patterns of organ regeneration. eLife. 7, (2018).
- Morsch, M., et al. Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (120), e54983 (2017).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Developmental Dynamics. 231 (2), 449-459 (2004).
- Kindt, K. S., Finch, G., Nicolson, T. Kinocilia mediate mechanosensitivity in developing zebrafish hair cells. Developmental Cell. 23 (2), 329-341 (2012).
- Toro, C., et al. Dopamine Modulates the Activity of Sensory Hair Cells. Journal of Neurosciences. 35 (50), 16494-16503 (2015).
- Dalle Nogare, D., Chitnis, A. B. A framework for understanding morphogenesis and migration of the zebrafish posterior Lateral Line primordium. Mechanisms of Development. 148, 69-78 (2017).
