Конфокальный микроскоп на основе лазерной абляции и регенерации анализа в клетках интернейромы зебры рыбы
Summary
Лазерная абляция является широко применимой технологией для изучения регенерации в биологических системах. Представленный протокол описывает использование стандартного лазерного сканирования конфокального микроскопа для лазерной абляции и последующей замедленной визуализации регенерирующих межнейромастов в боковой линии зебры.
Abstract
Клетки волос являются механосензорными клетками, которые являются посредниками в чувстве слуха. Эти клетки не регенерируются после повреждения у людей, но они естественным образом пополняются у не млекопитающих позвоночных, таких как зебры. Система боковой линии зебры является полезной моделью для характеристики сенсорной регенерации волосяных клеток. Боковой линии состоит из волосковых клеток, содержащих органы, называемые нейромастами, которые связаны друг с другом строкой межнейромальных клеток (INMCs). INMCs действуют как клетки-предшественники, которые дают возможность новых нейромастов во время развития. INMCs может восстановить пробелы в боковой линии системы, созданной клеточной смерти. Метод описан здесь для селективной абляции INMC с использованием обычного лазерного сканирования конфокального микроскопа и трансгенных рыб, которые выражают зеленый флуоресцентный белок в INMCs. Затем промежуток времени микроскопия используется для мониторинга регенерации INMC и определения скорости закрытия разрыва. Это представляет собой доступный протокол для абляции клеток, который не требует специального оборудования, такого как мощный импульсный ультрафиолетовый лазер. Протокол абляции может служить более широким интересам, так как он может быть полезен для абляции дополнительных типов ячеев, используя набор инструментов, который уже доступен для многих пользователей. Этот метод также позволит характеристика регенерации INMC в различных условиях и из различных генетических фонов, которые будут способствовать пониманию сенсорного регенерации клеток прародителя.
Introduction
В основе наиболее прогрессивной потери слуха лежит разрушение сенсорных волосковых клеток, которые трансдуцируемые внешние слуховые стимулы в нервные импульсы, обнаруживаемые мозгом. Кохлеарная смерть волосковых клеток вызывает постоянную потерю слуха, так как взрослые млекопитающие не имеют возможности регенерировать эти клетки после повреждения. И наоборот, не млекопитающих позвоночных, таких как зебрафиш может регенерировать волосковые клетки потеряли из-за акустической травмы или ототоксического оскорбления. Зебрафиш механосенсорий боковой линии является простой и легко манипулировать органной системы, которые могут быть использованы для изучениярегенерации волосяных клеток 1,2,3.
Боковой линии состоит из небольших сенсорных патчей, называемых нейромастами, которые связаны во время развития строкой удлиненных клеток, известных как межнейромастовые клетки (INMCs). Учитывая их пролиферативную способность в качестве очевидных стволовых клеток, которые дают возможность новых волосковых клеток, содержащих органы, поведение INMCs представляетбольшой интерес для сообщества 4,5. Большая часть исследований, относящихся к INMCs характеризуется подавление их распространения близлежащих клеток Шванн, которые обернуть вокруг боковой линии нерва, вероятно, через ингибитор Wnt / β-катенин сигнализации. 6,7,8. Хотя регулирование распространения INMC и дифференциации на новые нейромасты было хорошо описано, механизмы, регулирующие отрастание INMC после абляции, не были выяснены. Этот протокол служит средством ablating отдельных INMCs и анализа их последующего регенеративного поведения.
Были опубликованы различные методы уничтожения волосковых клеток, поддерживающих клетки и целые нейромасты, а также методологии мониторинга восстановления. Химическая абляция хорошо работает для волосковых клеток, но дозы токсичных химическихвеществ, таких как CuSO 4 должны быть значительно увеличены, чтобы удалить другие боковой линииклеток типов 9. Хотя электроаблирование при микроскопии флуоресценции является эффективным и простым средством уничтожения МНК для изучения регенерации, трудно ориентироваться узко и, следовательно, может привести к значительному сопутствующему ущербу. В результате, это может замаскировать аспекты INMC-специфического поведения10,11. Протоколы лазерной абляции были использованы, но они требуют использования специализированного оборудования не обязательно присутствует в средней лаборатории или объекта визуализации (т.е. мощные импульсныеУФ-лазеры 12). Описанный здесь метод может быть выполнен с помощью любого лазерного сканирования конфокального микроскопа, оснащенного обычным 405-нм лазером, обычно используемым для визуализации DAPI и других синих флюорофоров. Преимущество этого метода заключается в том, что конфокальные изображения могут быть выполнены непосредственно до и после повреждения клеток без привлечения каких-либо дополнительных систем лазерного управления или передачи в другой микроскоп, оснащенный импульсным лазером.
Аналогичный метод был описан для аблятинг нейронов в спинном мозге зебры13. Однако предыдущий метод требует модуля FRAP для абляции клеток, что не является требованием для этого протокола. Кроме того, учитывая различные свойства различных типов клеток (т.е. яркость трансгенной флуоресценции, глубину тела и форму клеток), вполне вероятно, что значительные изменения будут необходимы в зависимости от используемого типа клетки. Протокол подробно здесь, скорее всего, будет эффективным для более поверхностных клеток, как это подтверждается демонстрацией сенсорной абляции клеток волос с использованием того же метода. Также изложен анализ регенерации для оценки темпов восстановления INMC после абляции, которая не была особенностью вышеупомянутого исследования.
Протокол абляции клеток на основе лазера, подробно описанный в настоящем, фиксирует регенеративную способность INMCs за счет оптимизации лазерных условий, пред- и постабляционной визуализации и замедленной микроскопии. Эти элементы объединяются для всестороннего изображения отрастания и закрытия пробелов INMC в полном объеме. Хотя этот протокол используется здесь для уничтожения INMCs, он может быть применен к другой работе, которая требует надежной и эффективной оценки клеточной абляции. Это также доступная технология, так как она может быть проведена на любом конфокальный микроскоп оснащен 405 нм лазера.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол описывает универсальный метод абляции лазерных клеток, который может быть выполнен на любом конфокальцивном микроскопе, оснащенном почти ультрафиолетовым лазером (405 нм длины волны). В этом протоколе рассматриваются ограничения ранее используемых методов, таких как электроабляция (которая вызываетболее широкое повреждение 11)и импульсная УФ-лазерная абляция (которая требует дополнительного специализированногооборудования 12). Пред- и после абляционная конфокальные изображения обеспечивают быструю обратную связь относительно успеха эксперимента. Последующая покадровая микроскопия предлагает простой анализ для регенерации в клеточном типе, критически важном для развития сенсорной системы.
Это жизненно важно для предварительного проверки для трансгенных зебры, которые выражают GFP сильно в нейромасты и INMCs. Личинки с яркой флуоресценцией и примерно равномерноями, полученными из primI, являются идеальными кандидатами для лазерной абляции. Даже в этих рыб, Есть иногда тусклым INMCs, которые могут на первый побег обнаружения. Эти клетки могут оставаться позади после лазерной абляции, предотвращая образование истинного разрыва между INMCs. Цифровой прирост должен быть скорректирован, чтобы выявить эти тусклые клетки во время предварительной абляции изображения таким образом, что они также могут быть направлены с 405 нм лазера (шаг 8.2).
Аналогичным образом, лазерная ориентация иногда не будет полностью уничтожить ячейку; скорее, это будет отбеливать флуоресценцию, в результате чего не создать реальный разрыв. Эти клетки, как правило, увеличение флуоресценции во время микроскопии timelapse. Корректировка усиления на этапе визуализации после абляции наряду с T-PMT imaging(рисунок 2)поможет гарантировать, что все целевые клетки были эффективно удалены. Для создания зазора в строке INMC часто требуется два или три отдельных клеточных абляции. Гибель клеток может быть обнаружена путем blebbing или гранулированного появления в целевых клетках; хотя, это может потребовать короткого периода ожидания после лазерного прицелии (а в некоторых случаях, очевидные апоптотические или некротические фигуры наблюдаются вскоре после этого).
Ограничение этой процедуры заключается в том, что она может потребовать нескольких экспериментальных испытаний, прежде чем лазерные условия оптимизированы и регенерация INMC является успешной. Лазерная мощность и общее время обитуемого лазера могут потребовать небольшой корректировки для различных образцов. Было установлено, что чрезмерное применение лазера может ухудшить способность боковой линии к саморемонту. Это включает в себя как 1) чрезмерное воздействие отдельных клеток на лазерное облучение, предположительно вызывая дополнительные повреждения окружающих тканей, а также 2) абляция слишком много клеток в строке, что приводит к большему разрыву. Пользователи должны достичь баланса между достаточно облучающих клеток, чтобы обеспечить их разрушение, а не переэкспонировать клетки, которые могут замедлить или предотвратить регенерацию. При соответствующих настройках, было установлено, что INMCs могут быть удалены без видимых повреждений задней боковой линии нерва, указывая, что сопутствующий ущерб сводится к минимуму с помощью этого протокола в отличие отэлектроабляции 11. Ни в одной из случаев не были новые нейромасты формирования в разрыв наблюдается, предположительно потому, что боковой нерв линии остается нетронутым и основные глиальные клетки остаются иподавляют распространениеINMCs 6,7,8,11.
Попродемонстрировано, что этот метод конфокального лазерного абляции может быть применен и к другим типам клеток, особенно в тех, которые поверхностно расположены внутри животного, включая сенсорные волосяныеклетки (рисунок 4). Аналогичный протокол может быть использован для аблата клеток кожи для изучения раны ремонт или нейронов для аксональной регенерации исследований, как ранее описано13. Предполагается, что этот метод станет полезным дополнением к экспериментальному репертуару лабораторий, обладающих конфокальцатором, но не обладающих другим специализированным оборудованием для лазерной абляции.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась за счет гранта NIH R15 1R15DC015352-01A1 и внутренних источников финансирования Университета Пейс. Рыбные линии были предоставлены ВладимирКорж 14,Кэти Kindt 15,16, и лаборатория А. Джеймс Хадспет. Мы хотели бы поблагодарить А. Джеймса Хадспета и членов его группы за отзывы об этих экспериментах, а также коллег из Университета Пейс за их поддержку. Анализу логистической регрессии в RStudio, в частности, помогал наш коллега Мэтью Айелло-Ламмерс.
Materials
| 12-well PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Sciences | 63425-05 | |
| 15 mM Tricaine stock solution | Sigma | E10521 | 15 mM Tricaine in reverse osmosis water |
| 1X E3 + 600 µM Tricaine | Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media | ||
| 1X E3 media | Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L) | ||
| 60 X E3 media | All components purchased from Sigma-Aldrich | 34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water | |
| Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence | Olympus | ||
| LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers | Carl Zeiss Microscopy, LLC | A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40 | |
| FIJI/ImageJ Image processing software | Multiple contributors | Downloadable at https://fiji.sc/ | |
| Dissecting needle modified into hair knife | Fisher Scientific | 19010 | An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle |
| Microsoft Excel software | Microsoft Corp. | Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel | |
| Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window | Mattek Corporation | P35G-1.5-20-C | 35 mm petri dish, 20 mm glass window |
| Immersol 518F Immersion Oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Low Gelling Agarose | Sigma Life Science | A9414-256 | |
| Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert | Millipore Sigma | CLS3479-48EA | |
| Rstudio software | Rstudio PBC | Downloadable at https://rstudio.com/ | |
| SMX-168-BL Stereo microscope | Motic | ||
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| ZEN software | Carl Zeiss Microscopy, LLC |
References
- Denans, N., Baek, S., Piotrowski, T. Comparing Sensory Organs to Define the Path for Hair Cell Regeneration. Annual Review Cell & Developmental Biology. 35, 567-589 (2019).
- Ghysen, A., Dambly-Chaudiere, C. The lateral line microcosmos. Genes & Development. 21 (17), 2118-2130 (2007).
- Lush, M. E., Piotrowski, T. Sensory hair cell regeneration in the zebrafish lateral line. Dev Dyn. 243 (10), 1187-1202 (2014).
- Ledent, V. Postembryonic development of the posterior lateral line in zebrafish. Development. 129 (3), 597-604 (2002).
- Nunez, V. A., et al. Postembryonic development of the posterior lateral line in the zebrafish. Evolution and Development. 11 (4), 391-404 (2009).
- Grant, K. A., Raible, D. W., Piotrowski, T. Regulation of latent sensory hair cell precursors by glia in the zebrafish lateral line. Neuron. 45 (1), 69-80 (2005).
- Lopez-Schier, H., Hudspeth, A. J. Supernumerary neuromasts in the posterior lateral line of zebrafish lacking peripheral glia. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 102 (5), 1496-1501 (2005).
- Lush, M. E., Piotrowski, T. ErbB expressing Schwann cells control lateral line progenitor cells via non-cell-autonomous regulation of Wnt/beta-catenin. eLife. 3, 01832 (2014).
- Hernandez, P. P., et al. Sublethal concentrations of waterborne copper induce cellular stress and cell death in zebrafish embryos and larvae. Biological Research. 44 (1), 7-15 (2011).
- Moya-Diaz, J., et al. Electroablation: a method for neurectomy and localized tissue injury. BMC Developmental Biology. 14, 7 (2014).
- Sanchez, M., Ceci, M. L., Gutierrez, D., Anguita-Salinas, C., Allende, M. L. Mechanosensory organ regeneration in zebrafish depends on a population of multipotent progenitor cells kept latent by Schwann cells. BMC Biology. 14, 27 (2016).
- Viader-Llargues, O., Lupperger, V., Pola-Morell, L., Marr, C., Lopez-Schier, H. Live cell-lineage tracing and machine learning reveal patterns of organ regeneration. eLife. 7, (2018).
- Morsch, M., et al. Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (120), e54983 (2017).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Developmental Dynamics. 231 (2), 449-459 (2004).
- Kindt, K. S., Finch, G., Nicolson, T. Kinocilia mediate mechanosensitivity in developing zebrafish hair cells. Developmental Cell. 23 (2), 329-341 (2012).
- Toro, C., et al. Dopamine Modulates the Activity of Sensory Hair Cells. Journal of Neurosciences. 35 (50), 16494-16503 (2015).
- Dalle Nogare, D., Chitnis, A. B. A framework for understanding morphogenesis and migration of the zebrafish posterior Lateral Line primordium. Mechanisms of Development. 148, 69-78 (2017).
