Ablação e Regeneração a laser baseada em microscópio confocal em células interneuromast baseadas em zebrafish
Summary
A ablação a laser é uma tecnologia amplamente aplicável para estudar a regeneração em sistemas biológicos. O protocolo apresentado descreve o uso de um microscópio confocal padrão de varredura a laser para ablação a laser e imagens subsequentes de lapso de tempo de células interneuromast regeneradoras na linha lateral do zebrafish.
Abstract
Células ciliar são células mecanosensoriais que mediam o sentido de audição. Essas células não se regeneram após danos em humanos, mas são naturalmente reabastecidas em vertebrados não-mamíferos, como o zebrafish. O sistema de linha lateral zebrafish é um modelo útil para caracterizar a regeneração celular sensorial. A linha lateral é composta por órgãos contendo células ciliar chamadas neuromass, que são ligados por uma série de células interneuromast (INMCs). Os INMCs atuam como células progenitoras que dão origem a novos neuromass durante o desenvolvimento. Os INMCs podem reparar lacunas no sistema de linha lateral criado por morte celular. Um método é descrito aqui para ablação seletiva do INMC usando um microscópio confocal convencional de varredura a laser e peixes transgênicos que expressam proteína fluorescente verde em INMCs. A microscopia de lapso de tempo é então usada para monitorar a regeneração do INMC e determinar a taxa de fechamento de lacunas. Isso representa um protocolo acessível para ablação celular que não requer equipamento especializado, como um laser ultravioleta pulsado de alta potência. O protocolo de ablação pode servir a interesses mais amplos, pois pode ser útil para a ablação de tipos de células adicionais, empregando um conjunto de ferramentas que já está disponível para muitos usuários. Essa técnica permitirá ainda a caracterização da regeneração do INMC em diferentes condições e de diferentes origens genéticas, o que avançará na compreensão da regeneração celular progenitora sensorial.
Introduction
No cerne da perda auditiva mais progressiva está a destruição de células ciliares sensoriais, que transduzim estímulos auditivos extrínsecos em impulsos nervosos detectáveis pelo cérebro. A morte da célula ciliar coclear causa perda auditiva permanente, já que os mamíferos adultos não têm a capacidade de regenerar essas células após danos. Por outro lado, vertebrados não-mamíferos, como o zebrafish, podem regenerar células ciliares perdidas por trauma acústico ou insulto otoxico. A linha lateral mecanosensrial de zebrafish é um sistema de órgãos simples e facilmente manipulado que pode ser usado para estudar a regeneração das células ciliar1,2,3.
A linha lateral consiste em pequenas manchas sensoriais chamadas neuromass, que são conectadas durante o desenvolvimento por uma cadeia de células alongadas conhecidas como células interneuromast (INMCs). Dada a sua capacidade proliferativa como células-tronco aparentes que dão origem a novos órgãos contendo células ciliares, o comportamento dos INMCs é de grande interesse para a comunidade4,5. Grande parte das pesquisas relativas aos INMCs caracterizou a supressão de sua proliferação por células schwann próximas que envolvem o nervo da linha lateral, provavelmente através de um inibidor de sinalização Wnt/β-catenin. 6,7,8. Embora a regulação da proliferação e diferenciação do INMC em novos neuromass tenha sido bem descrita, os mecanismos que regem o recrescimento do INMC após a ablação não foram elucidados. Este protocolo serve como um meio de ablação de INMCs individuais e análise de seu comportamento regenerativo subsequente.
Uma variedade de métodos para destruir células ciliar, células de apoio e neuromass inteiros foram publicados, juntamente com metodologias para monitorar a recuperação. A ablação química funciona bem para as células ciliadas, mas doses de produtos químicos tóxicos como o CuSO4 devem ser significativamente aumentadas para remover outros tipos de células de linha lateral9. Embora a eletroapiação sob microscopia de fluorescência seja um meio eficaz e simples de destruir INMCs para estudar a regeneração, é difícil atingir de forma restrita e, portanto, é provável que produza danos colaterais significativos. Como resultado, isso pode mascarar aspectos de comportamentos específicos do INMC10,11. Protocolos de ablação a laser foram empregados, mas exigem o uso de equipamentos especializados não necessariamente presentes no laboratório médio ou instalação de imagem (ou seja, lasers UV pulsados de alta potência12). O método descrito aqui pode ser realizado com qualquer microscópio confocal de varredura a laser equipado com o laser comum de 405 nm, geralmente usado para imagem DAPI e outros fluoroforos azuis. Uma vantagem deste método é que a imagem confocal pode ser realizada imediatamente antes e depois do dano celular sem envolver nenhum sistema adicional de controle de laser ou transferir para outro microscópio equipado com um laser pulsado.
Um método semelhante foi descrito para ablação de neurônios na medulaespinhal zebrafish 13. No entanto, o método anterior requer um módulo FRAP para ablação celular, o que não é um requisito para este protocolo. Além disso, dadas as distintas propriedades de diferentes tipos de células (ou seja, brilho da fluorescência transgênica, profundidade dentro do corpo e forma celular), é provável que modificações significativas sejam necessárias dependendo do tipo de célula utilizada. O protocolo detalhado aqui é mais provável que seja eficaz para células mais superficiais, como apoiado por uma demonstração de ablação de células ciliadas sensoriais usando o mesmo método. Também está delineado um ensaio de regeneração para avaliar as taxas de recuperação do INMC após a ablação, o que não foi uma característica do estudo acima mencionado.
O protocolo de ablação celular baseado em laser aqui detalhado captura a capacidade regenerativa dos INMCs através da otimização de condições de laser, imagens pré e pós-ablação e microscopia de lapso de tempo. Esses elementos se unem para retratar de forma abrangente o crescimento e o fechamento de lacunas da INMC em sua totalidade. Embora este protocolo seja usado aqui para destruir INMCs, ele pode ser aplicado a outros trabalhos que exigem avaliação confiável e eficaz da ablação celular. É também uma tecnologia acessível, uma vez que pode ser conduzida em qualquer microscópio confocal equipado com um laser de 405 nm.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descreve um método versátil para ablação de células laser que pode ser realizado em qualquer microscópio confocal equipado com um laser quase ultravioleta (comprimento de onda de 405 nm). Este protocolo aborda limitações de métodos previamente empregados, como eletroablação (que causa danos mais generalizados11) e ablação uv-laser pulsada (que requer equipamento especializado adicional12). Imagens confocal pré e pós-ablação fornecem feedback rápido sobre o sucesso do experimento. A microscopia de lapso de tempo subsequente oferece um ensaio simples para regeneração em um tipo de célula crítico para o desenvolvimento do sistema sensorial.
É de vital importância pré-tela para zebrafish transgênicos que expressam fortemente gfp em neuromasts e INMCs. Larvas com fluorescência brilhante e aproximadamente espaçamento dos neuromass derivados primI são candidatos ideais para ablação a laser. Mesmo nestes peixes, ocasionalmente há INMCs mais dimmer que podem, a princípio, escapar da detecção. Essas células podem ficar para trás após a ablação a laser, impedindo a formação de uma verdadeira lacuna entre os INMCs. O ganho digital deve ser ajustado para revelar essas células dimmer durante a imagem pré-ablação de tal forma que elas também podem ser direcionadas com o laser de 405 nm (passo 8.2).
Da mesma forma, o alvo a laser às vezes não destruirá totalmente uma célula; em vez disso, vai branquear a fluorescência, resultando em uma falha em criar uma lacuna real. Essas células geralmente aumentarão a fluorescência durante a microscopia timelapse. Ajuste de ganho na etapa de imagem pós-ablação, juntamente com a imagem T-PMT(Figura 2) ajudam a garantir que todas as células visadas tenham sido efetivamente removidas. Ele frequentemente requer duas ou três ablações de células individuais para produzir uma lacuna na sequência INMC. A morte celular pode ser detectada por blebbing ou uma aparência granular nas células alvo; embora, isso pode exigir um breve período de espera após o alvo do laser (e, em alguns casos, figuras aparentes apoptóticas ou necrosas são observadas pouco tempo depois).
Uma limitação deste procedimento é que ele pode exigir vários ensaios experimentais antes que as condições de laser sejam otimizadas e a regeneração do INMC seja bem sucedida. A potência do laser e o tempo total de consumo do laser podem exigir um pequeno ajuste para diferentes amostras. Verificou-se que a aplicação excessiva de laser pode prejudicar a capacidade da linha lateral de se reparar. Isso inclui tanto a superexposição de células individuais à irradiação a laser, presumivelmente causando danos adicionais aos tecidos circundantes, bem como 2) a ablação de muitas células na corda, levando a uma lacuna maior. Os usuários devem alcançar um equilíbrio entre células suficientemente irradiadas para garantir sua destruição e não expor demais as células, o que pode retardar ou impedir a regeneração. Com as configurações apropriadas, verificou-se que os INMCs podem ser removidos sem danos visíveis ao nervo da linha lateral posterior, indicando que os danos colaterais são minimizados com este protocolo ao contrário da eletroablação11. Em nenhum caso foram observados novos neuromass na lacuna observada, presumivelmente porque o nervo da linha lateral permanece intacto e as células gliais subjacentes permanecem e inibem a proliferação dos INMCs6,7,8,11.
Demonstra-se que esse método de ablação a laser confocal pode ser aplicado a outros tipos de células também, particularmente naqueles superficialmente localizados dentro do animal, incluindo células ciliadas sensoriais(Figura 4). Um protocolo semelhante pode ser usado para ablatar células da pele para examinar reparação de feridas ou neurônios para estudos de regeneração axonal, como descrito anteriormente13. Espera-se que essa técnica se torne uma adição útil ao repertório experimental de laboratórios que possuem um microscópio confocal, mas nenhum outro equipamento especializado para ablação a laser.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelas fontes de financiamento interno NIH R15 Grant 1R15DC015352-01A1 e Pace University. As linhas de peixe foram cortesia de Vladimir Korzh14, Katie Kindt15,16, e do laboratório de A. James Hudspeth. Gostaríamos de agradecer a A. James Hudspeth e membros de seu grupo por feedback sobre esses experimentos, e colegas da Pace University por seu apoio. A análise de regressão logística no RStudio foi auxiliada em particular pelo nosso colega Matthew Aiello-Lammens.
Materials
| 12-well PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Sciences | 63425-05 | |
| 15 mM Tricaine stock solution | Sigma | E10521 | 15 mM Tricaine in reverse osmosis water |
| 1X E3 + 600 µM Tricaine | Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media | ||
| 1X E3 media | Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L) | ||
| 60 X E3 media | All components purchased from Sigma-Aldrich | 34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water | |
| Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence | Olympus | ||
| LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers | Carl Zeiss Microscopy, LLC | A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40 | |
| FIJI/ImageJ Image processing software | Multiple contributors | Downloadable at https://fiji.sc/ | |
| Dissecting needle modified into hair knife | Fisher Scientific | 19010 | An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle |
| Microsoft Excel software | Microsoft Corp. | Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel | |
| Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window | Mattek Corporation | P35G-1.5-20-C | 35 mm petri dish, 20 mm glass window |
| Immersol 518F Immersion Oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Low Gelling Agarose | Sigma Life Science | A9414-256 | |
| Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert | Millipore Sigma | CLS3479-48EA | |
| Rstudio software | Rstudio PBC | Downloadable at https://rstudio.com/ | |
| SMX-168-BL Stereo microscope | Motic | ||
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| ZEN software | Carl Zeiss Microscopy, LLC |
References
- Denans, N., Baek, S., Piotrowski, T. Comparing Sensory Organs to Define the Path for Hair Cell Regeneration. Annual Review Cell & Developmental Biology. 35, 567-589 (2019).
- Ghysen, A., Dambly-Chaudiere, C. The lateral line microcosmos. Genes & Development. 21 (17), 2118-2130 (2007).
- Lush, M. E., Piotrowski, T. Sensory hair cell regeneration in the zebrafish lateral line. Dev Dyn. 243 (10), 1187-1202 (2014).
- Ledent, V. Postembryonic development of the posterior lateral line in zebrafish. Development. 129 (3), 597-604 (2002).
- Nunez, V. A., et al. Postembryonic development of the posterior lateral line in the zebrafish. Evolution and Development. 11 (4), 391-404 (2009).
- Grant, K. A., Raible, D. W., Piotrowski, T. Regulation of latent sensory hair cell precursors by glia in the zebrafish lateral line. Neuron. 45 (1), 69-80 (2005).
- Lopez-Schier, H., Hudspeth, A. J. Supernumerary neuromasts in the posterior lateral line of zebrafish lacking peripheral glia. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 102 (5), 1496-1501 (2005).
- Lush, M. E., Piotrowski, T. ErbB expressing Schwann cells control lateral line progenitor cells via non-cell-autonomous regulation of Wnt/beta-catenin. eLife. 3, 01832 (2014).
- Hernandez, P. P., et al. Sublethal concentrations of waterborne copper induce cellular stress and cell death in zebrafish embryos and larvae. Biological Research. 44 (1), 7-15 (2011).
- Moya-Diaz, J., et al. Electroablation: a method for neurectomy and localized tissue injury. BMC Developmental Biology. 14, 7 (2014).
- Sanchez, M., Ceci, M. L., Gutierrez, D., Anguita-Salinas, C., Allende, M. L. Mechanosensory organ regeneration in zebrafish depends on a population of multipotent progenitor cells kept latent by Schwann cells. BMC Biology. 14, 27 (2016).
- Viader-Llargues, O., Lupperger, V., Pola-Morell, L., Marr, C., Lopez-Schier, H. Live cell-lineage tracing and machine learning reveal patterns of organ regeneration. eLife. 7, (2018).
- Morsch, M., et al. Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (120), e54983 (2017).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Developmental Dynamics. 231 (2), 449-459 (2004).
- Kindt, K. S., Finch, G., Nicolson, T. Kinocilia mediate mechanosensitivity in developing zebrafish hair cells. Developmental Cell. 23 (2), 329-341 (2012).
- Toro, C., et al. Dopamine Modulates the Activity of Sensory Hair Cells. Journal of Neurosciences. 35 (50), 16494-16503 (2015).
- Dalle Nogare, D., Chitnis, A. B. A framework for understanding morphogenesis and migration of the zebrafish posterior Lateral Line primordium. Mechanisms of Development. 148, 69-78 (2017).
