מיקרוסקופ Confocal מבוסס לייזר אבלציה והתחדשות אדון בתאים Interneuromast דגי זברה
Summary
אבלציה בלייזר היא טכנולוגיה ישימה לחקר התחדשות במערכות ביולוגיות. הפרוטוקול המוצג מתאר שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי לסריקת לייזר לאבלציה בלייזר והדמיית זמן-לשגות של התחדשות תאים interneuromast בקו רוחבי של דגי הזברה.
Abstract
תאי שיער הם תאים מכנו-חושיים המתווכים את חוש השמיעה. תאים אלה אינם מתחדשים לאחר נזק בבני אדם, אך הם מתחדשים באופן טבעי בעלי חוליות שאינם יונקים כגון דגי זברה. מערכת הקו הניגב של דגי הזברה היא מודל שימושי לאפיון התחדשות תאי שיער חושיים. הקו לחוץ מורכב של איברים המכילים תא שיער הנקראים neuromasts, אשר מקושרים יחד על ידי מחרוזת של תאים interneuromast (INMCs). INMCs לפעול כתאי הצבי המביאים להובלת neuromasts חדש במהלך הפיתוח. INMCs יכולים לתקן פערים במערכת הקו החוץ-תאלי שנוצר על-ידי מוות של תאים. שיטה מתוארת כאן עבור אבלציה INMC סלקטיבית באמצעות מיקרוסקופ קונבנציונלי סורק לייזר confocal ודגים טרנסגניים המבטאים חלבון פלורסנט ירוק INMCs. מיקרוסקופית זמן לשגות משמש לאחר מכן כדי לפקח על התחדשות INMC ולקבוע את קצב סגירת הפער. זה מייצג פרוטוקול נגיש עבור אבלציה תא שאינו דורש ציוד מיוחד, כגון לייזר אולטרה סגול פעמו רב עוצמה. פרוטוקול אבלציה עשוי לשרת תחומי עניין רחבים יותר, כפי שהוא יכול להיות שימושי עבור אבלציה של סוגי תאים נוספים, שימוש בהסטת כלים שכבר זמינה למשתמשים רבים. טכניקה זו תאפשר עוד יותר את האפיון של התחדשות INMC בתנאים שונים ומרקעים גנטיים שונים, אשר יקדמו את ההבנה של התחדשות תאי האבות החושיים.
Introduction
בליבה של ליקוי שמיעה מתקדם ביותר טמון ההרס של תאי שיער חושיים, אשר מתמרים גירויים שמיעתיים חיצוניים לתוך דחפים עצביים לגילוי על ידי המוח. מוות תאי שיער שבלולי גורם לליקוי שמיעה קבוע, כמו יונקים בוגרים חסר את היכולת לחדש תאים אלה בעקבות נזק. לעומת זאת, בעלי חוליות שאינם יונקים כגון דגי זברה יכולים לחדש תאי שיער שאבדו לטראומה אקוסטית או לעלבון אוטוקסי. הקו המכנוזנסי של דגי הזברה הוא מערכת איברים פשוטה וקלות שניתן להשתמש בה כדי ללמוד התחדשות תאישיער 1,2,3.
הקו לחוץ מורכב מטלאים חושיים קטנים הנקראים neuromasts, המחוברים במהלך הפיתוח על ידי מחרוזת של תאים מוארך המכונה תאים interneuromast (INMCs). בהתחשב ביכולת ההתפשטות שלהם כתאי גזע לכאורה המהוים איברים המכילים תאי שיער חדשים, ההתנהגות של INMCs היא עניין רבלקהילה 4,5. חלק גדול מהמחקר הנוגע ל-INMCs איפיין דיכוי של התפשטותם על ידי תאי שוון סמוכים העוטפים את עצב הקו לרוחב, ככל הנראה באמצעות מעכב של איתות Wnt/β-catenin. שש,שבע,שמונה. בעוד הרגולציה של התפשטות INMC והבידול לתוך neuromasts חדש תואר היטב, המנגנונים השולטים INMC לגדול מחדש לאחר אבלציה לא הובך. פרוטוקול זה משמש כאמצעי לבלילת INMCs בודדים וניתוח התנהגות ההתחדשות שלהם לאחר מכן.
מגוון שיטות להשמדת תאי שיער, תאים תומכים, ו neuromasts שלם פורסמו, יחד עם מתודולוגיות לניטור התאוששות. אבלציה כימית עובד היטב עבור תאי שיער, אבל מינונים של כימיקלים רעילים כגון CuSO4 חייב להיות מוגבר באופן משמעותי כדי להסיר סוגים אחרים של תאי קולחוץ 9. בעוד אלקטרובלציה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא אמצעי יעיל ופשוט להשמדת INMCs כדי ללמוד התחדשות, קשה למקד באופן צר, ולכן, עשוי לייצר נזק משני משמעותי. כתוצאה מכך, הדבר יכול להסוות היבטים של התנהגויות ספציפיות ל- INMC10,11. פרוטוקולי אבלציה לייזר הועסקו, אבל הם דורשים את השימוש בציוד מיוחד לא בהכרח קיים במעבדה הממוצעת או במתקן הדמיה (כלומר, לייזרים UV פעמורבי עוצמה 12). השיטה המתוארת כאן יכולה להתבצע עם כל מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר לבוש עם לייזר נפוץ 405 nm, משמש בדרך כלל עבור DAPI הדמיה ופלואורופורים כחולים אחרים. יתרון של שיטה זו הוא כי הדמיה confocal יכול להתבצע מיד לפני ואחרי נזק לתא מבלי לעסוק בכל מערכות בקרת לייזר נוספות או העברה למיקרוסקופ אחר מצויד לייזר פעמו.
שיטה דומה תוארה עבור נוירונים מבלבלים בחוט השדרה של דגי הזברה13. עם זאת, השיטה הקודמת דורשת מודול FRAP עבור אבלציה של תאים, שאינה דרישה עבור פרוטוקול זה. יתר על כן, בהתחשב במאפיינים הייחודיים של סוגי תאים שונים (כלומר, בהירות של פלואורסקנציה טרנסג’נדרית, עומק בתוך הגוף, וצורת התא), סביר להניח כי יהיה צורך בשינויים משמעותיים בהתאם לסוג התא המשמש. הפרוטוקול המפורט כאן סביר יותר להיות יעיל עבור תאים שטחיים יותר, כפי נתמך על ידי הדגמה של אבלציה תא שיער חושי באותה שיטה. כמו כן מתואר הוא התחדשות תוואי כדי להעריך את שיעורי ההתאוששות INMC לאחר אבלציה, אשר לא היה תכונה של המחקר הנ”ל.
פרוטוקול אבלציה תא מבוסס לייזר מפורט בכאן לוכד את היכולת ההתחדשות של INMCs באמצעות אופטימיזציה של תנאי לייזר, הדמיה לפני ולאחר אבלציה, ומיקרוסקופית זמן לשגות. אלמנטים אלה מתאחדים כדי להציג באופן מקיף את ההתארגנות מחדש של INMC ואת סגירת הפער בשלמותה. בעוד פרוטוקול זה משמש כאן כדי להרוס INMCs, זה עשוי להיות מיושם על עבודה אחרת הדורשת הערכה אמינה ויעילה של אבלציה סלולרית. זוהי גם טכנולוגיה נגישה, שכן ניתן לתנהל על כל מיקרוסקופ קונפוקאלי המצויד בלייזר 405 אף-מ”ר.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול מתאר שיטה רב-תכליתית לאבלציה של תאי לייזר שניתן לבצע על כל מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בלייזר אולטרה סגול כמעט (אורך גל של 405 00 00 00 00 00 00 00 00:00). פרוטוקול זה מטפל במגבלות של שיטות שהועסקו בעבר כגון אלקטרובלציה (אשר גורמת נזק נרחב יותר11)ופעמו אבלציה UV-לייזר (אשר דורש ציוד מיוחד נוסף12). הדמיה קונפוקלית לפני ולאחר אבלציה מספקת משוב מהיר בנוגע להצלחת הניסוי. מיקרוסקופית זמן לאחר מכן מציעה אחסון פשוט להתחדשות בסוג תא קריטי לפיתוח מערכת חושית.
יש חשיבות חיונית למסך מראש עבור דגי זברה טרנסגניים המביעים GFP בחוזקה בנוירומאסט ו- INMCs. זחלים עם פלואורסצנה בהירה ואפילו מרווח של neuromasts נגזר primI הם מועמדים אידיאליים לאבלציה לייזר. אפילו בדגים אלה, מדי פעם יש INMCs עמעום שעשויים בתחילה לברוח זיהוי. תאים אלה יכולים להישאר מאחור לאחר אבלציה לייזר, מניעת היווצרות של פער אמיתי בין INMCs. הרווח הדיגיטלי צריך להיות מותאם כדי לחשוף תאים עמעום אלה במהלך הדמיית טרום אבלציה כך שהם יכולים גם להיות ממוקד עם לייזר 405 nm (שלב 8.2).
באופן דומה, מיקוד לייזר לפעמים לא לגמרי להרוס תא; במקום זאת, זה יהיה להלבין את הפלואורסץ, וכתוצאה מכך כישלון ליצור פער אמיתי. תאים אלה בדרך כלל להגדיל פלואורסצנית במהלך מיקרוסקופית timelapse. קבל התאמה בשלב ההדמיה שלאחר אבלציה יחד עם הדמיית T-PMT (איור 2) מסייעים להבטיח שכל התאים המיועדים הוסרו ביעילות. לעתים קרובות נדרשים שניים או שלושה אבלות תאים בודדות כדי להפיק רווח במחרוזת INMC. מוות של תאים יכול להתגלות על ידי blebbing או מראה פרטניים בתאים המיועדים; למרות, זה עשוי לדרוש תקופת המתנה קצרה לאחר מיקוד לייזר (ובמקרים מסוימים, דמויות אפופטוטיות או נמק לכאורה נצפו זמן קצר לאחר מכן).
מגבלה של הליך זה היא שזה עשוי לדרוש ניסויים ניסיוניים מרובים לפני תנאי לייזר ממוטבים והתחדשות INMC הוא מוצלח. כוח הלייזר וזמן ההתעכבות הכולל של הלייזר עשויים לדרוש התאמה קלה עבור דגימות שונות. נמצא כי יישום לייזר מוגזם יכול לפגוע ביכולת של הקו לדרכך כדי לתקן את עצמו. זה כולל גם 1) חשיפת יתר של תאים בודדים להקרן לייזר, ככל הנראה גרימת נזק נוסף לרקמות שמסביב, כמו גם 2) אבלציה של תאים רבים מדי במחרוזת, המוביל לפער גדול יותר. על המשתמשים להשיג איזון בין תאים מ מקרינים מספיק כדי להבטיח את השמדתם ולא להגזים יתר על על כן בתאים, דבר שיכול להאט או למנוע התחדשות. עם ההגדרות המתאימות, נמצא כי INMCs ניתן להסיר ללא נזק גלוי לעצב הקו האחורי לצדדית, המציין כי נזק משני ממוזער עם פרוטוקול זה בניגוד electroablation11. בשום מקרים לא היו neuromasts חדשים יוצרים בפער שנצפה, ככל הנראה בגלל עצב הקו לחוץ נשאר שלם ותאי גליה הבסיסיים להישאר לעכב את ההתפשטות של INMCs6,7,8,11.
הוכח כי שיטה זו של אבלציה לייזר confocal עשוי להיות מיושם על סוגי תאים אחרים, כמו גם, במיוחד אלה הממוקמים באופן שטחי בתוך החיה כולל תאי שיער חושיים(איור 4). פרוטוקול דומה עשוי לשמש כדי לבלבל תאי עור כדי לבחון תיקון הפצע או נוירונים עבור מחקרי התחדשות סקסוניים, כפי שתואר קודםלכן 13. הוא צפוי כי טכניקה זו תהפוך תוספת שימושית רפרטואר ניסיוני של מעבדות בעלי מיקרוסקופ confocal אבל אין ציוד מיוחד אחר עבור אבלציה לייזר.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי NIH R15 מענק 1R15DC015352-01A1 ופייס אוניברסיטת מקורות מימון פנימיים. קווי הדגים היו באדיבות ולדימירקורז’ 14, קייטיקנדט 15,16,והמעבדה של א. ג’יימס האדספט. ברצוננו להודות לא. ג’יימס האדספת’ וחברי קבוצתו על המשוב על ניסויים אלה, ועמיתים באוניברסיטת פייס על תמיכתם. ניתוח רגרסיה לוגיסטית ב-RStudio נעזר במיוחד על ידי עמיתנו מתיו איילו-למנס.
Materials
| 12-well PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Sciences | 63425-05 | |
| 15 mM Tricaine stock solution | Sigma | E10521 | 15 mM Tricaine in reverse osmosis water |
| 1X E3 + 600 µM Tricaine | Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media | ||
| 1X E3 media | Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L) | ||
| 60 X E3 media | All components purchased from Sigma-Aldrich | 34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water | |
| Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence | Olympus | ||
| LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers | Carl Zeiss Microscopy, LLC | A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40 | |
| FIJI/ImageJ Image processing software | Multiple contributors | Downloadable at https://fiji.sc/ | |
| Dissecting needle modified into hair knife | Fisher Scientific | 19010 | An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle |
| Microsoft Excel software | Microsoft Corp. | Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel | |
| Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window | Mattek Corporation | P35G-1.5-20-C | 35 mm petri dish, 20 mm glass window |
| Immersol 518F Immersion Oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Low Gelling Agarose | Sigma Life Science | A9414-256 | |
| Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert | Millipore Sigma | CLS3479-48EA | |
| Rstudio software | Rstudio PBC | Downloadable at https://rstudio.com/ | |
| SMX-168-BL Stereo microscope | Motic | ||
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| ZEN software | Carl Zeiss Microscopy, LLC |
References
- Denans, N., Baek, S., Piotrowski, T. Comparing Sensory Organs to Define the Path for Hair Cell Regeneration. Annual Review Cell & Developmental Biology. 35, 567-589 (2019).
- Ghysen, A., Dambly-Chaudiere, C. The lateral line microcosmos. Genes & Development. 21 (17), 2118-2130 (2007).
- Lush, M. E., Piotrowski, T. Sensory hair cell regeneration in the zebrafish lateral line. Dev Dyn. 243 (10), 1187-1202 (2014).
- Ledent, V. Postembryonic development of the posterior lateral line in zebrafish. Development. 129 (3), 597-604 (2002).
- Nunez, V. A., et al. Postembryonic development of the posterior lateral line in the zebrafish. Evolution and Development. 11 (4), 391-404 (2009).
- Grant, K. A., Raible, D. W., Piotrowski, T. Regulation of latent sensory hair cell precursors by glia in the zebrafish lateral line. Neuron. 45 (1), 69-80 (2005).
- Lopez-Schier, H., Hudspeth, A. J. Supernumerary neuromasts in the posterior lateral line of zebrafish lacking peripheral glia. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 102 (5), 1496-1501 (2005).
- Lush, M. E., Piotrowski, T. ErbB expressing Schwann cells control lateral line progenitor cells via non-cell-autonomous regulation of Wnt/beta-catenin. eLife. 3, 01832 (2014).
- Hernandez, P. P., et al. Sublethal concentrations of waterborne copper induce cellular stress and cell death in zebrafish embryos and larvae. Biological Research. 44 (1), 7-15 (2011).
- Moya-Diaz, J., et al. Electroablation: a method for neurectomy and localized tissue injury. BMC Developmental Biology. 14, 7 (2014).
- Sanchez, M., Ceci, M. L., Gutierrez, D., Anguita-Salinas, C., Allende, M. L. Mechanosensory organ regeneration in zebrafish depends on a population of multipotent progenitor cells kept latent by Schwann cells. BMC Biology. 14, 27 (2016).
- Viader-Llargues, O., Lupperger, V., Pola-Morell, L., Marr, C., Lopez-Schier, H. Live cell-lineage tracing and machine learning reveal patterns of organ regeneration. eLife. 7, (2018).
- Morsch, M., et al. Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (120), e54983 (2017).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Developmental Dynamics. 231 (2), 449-459 (2004).
- Kindt, K. S., Finch, G., Nicolson, T. Kinocilia mediate mechanosensitivity in developing zebrafish hair cells. Developmental Cell. 23 (2), 329-341 (2012).
- Toro, C., et al. Dopamine Modulates the Activity of Sensory Hair Cells. Journal of Neurosciences. 35 (50), 16494-16503 (2015).
- Dalle Nogare, D., Chitnis, A. B. A framework for understanding morphogenesis and migration of the zebrafish posterior Lateral Line primordium. Mechanisms of Development. 148, 69-78 (2017).
