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Environment

Grabación extracelular multiinsular del nervio olfativo de los teleosts

Published: October 06, 2020
doi:
10.3791/60962
,
1Centro de Ciências do Mar, 2Universidade do Algarve

Summary

El registro extracelular multi-unidad del nervio olfativo es un método sensible, robusto y reproducible para evaluar la sensibilidad olfativa en peces marinos. Registra la entrada sensorial primaria y es independiente de la salinidad externa.

Abstract

Estudios recientes han demostrado que la acidificación de los océanos afecta el comportamiento olfativo en los peces. Esto puede deberse en parte a una reducción de la sensibilidad olfativa en agua alta PCO2/bajo pH. Para evaluar los efectos de la acidificación oceánica, o sensibilidad olfativa en los peces marinos en general, proponemos que el registro extracelular multi-unidad desde el nervio olfativo es el método de elección. Aunque invasivo, es sensible, robusto, reproducible e independiente de la salinidad externa (a diferencia del electro-olfactograma [EOG], por ejemplo). Además, registra una entrada sensorial primaria en el CNS, antes de cualquier procesamiento central. Mostramos que este método puede mostrar una reducción en la sensibilidad olfativa que es tanto temporal como dependiente del olor, utilizando una gama de aminoácidos para construir curvas de concentración-respuesta y calcular los umbrales de detección.

Introduction

Los peces dependen en gran medida de la olfacción para muchos aspectos de sus vidas, incluyendo la búsqueda de alimentos, la prevención de depredadores, la evaluación de posibles compañeros y la migración, entre otros1,2,3. Por lo tanto, evaluar la sensibilidad olfativa en los peces (¿Qué huelen? ¿Qué tan sensibles son a estos compuestos?) es vital para comprender plenamente estos procesos. Además, los efectos antropogénicos sobre el medio ambiente, como la acidificación de los océanos y la contaminación, pueden tener efectos profundos en el sistema olfativo, incluso a niveles subletales, porque está necesariamente en contacto íntimo con el agua circundante4. La electrofisiología in vivo es el enfoque experimental de elección para evaluar la sensibilidad olfativa en los peces. Existen tres técnicas principales: el electro-olfactograma (EOG), el electrocefalograma (EEG) registrado a partir de la bombilla olfativa y el registro multi-unidad desde el nervio olfativo5.

El EOG es el más utilizado de estos tres6. Es un potencial de campo de corriente directa (DC) registrado por encima del epitelio olfativo y se cree que es el potencial generador sumado de esas neuronas receptoras olfativas (ORN) que responden a un olor dado. Sin embargo, como se registra en el agua, en lugar de dentro del pez, la amplitud de la respuesta no sólo depende de la señal generada por los peces, sino también de la conductividad del agua circundante; cuanto mayor sea la conductividad (o menor sea la resistencia), menor será la amplitud. Esto puede significar que el EOG es un método menos sensible en el agua de mar que el agua dulce7.

El EEG registrado a partir de la bombilla olfativa también es ampliamente utilizado en la investigación de la olfacción en peces. Sin embargo, la bombilla olfativa es el centro de procesamiento de primer orden para la entrada sensorial olfativa8; está altamente organizado en glomérulos, y por lo tanto la respuesta registrada depende en gran medida de la posición de los electrodos de grabación. Por ejemplo, la entrada de ORN que detectan aminoácidos es procesada por glomérulos en la región lateral de las bombillas olfativas, mientras que la de productos químicos derivados de la conespecífico se dirige a la región medial9,10,11,12. La entrada feromonal puede dirigirse a glomérulos altamente localizados dentro de la bombilla olfativa. Dependiendo también de la anatomía de la especie en cuestión, la posición de registro ideal para un olor determinado puede no ser fácilmente accesible.

La grabación multiunidad desde el nervio olfativo elude los principales problemas con el EOG y el EEG descritos anteriormente. A medida que registra los potenciales de acciones que pasan por los axones de los ORN desde el epitelio a la bombilla, es una señal sensorial primaria. Y como se registra dentro del pez, la amplitud de la respuesta es independiente de la salinidad externa. Sin embargo, por supuesto que tiene algunas desventajas. En primer lugar, dependiendo de la anatomía de la especie, se requiere una cirugía más extensa para exponer el nervio olfativo que para el EOG. En segundo lugar, debido a que la señal es más pequeña que el EOG, requiere un equipo ligeramente más sofisticado, y por lo tanto caro. John Caprio5ofrece una descripción general de otros enfoques experimentales. El objetivo de este artículo es describir cómo registrar las respuestas extracelulares multi-unidad desde el nervio olfativo de la dorada (Sparus aurata) in vivo a los olorantes de aminoácidos como un ejemplo de esta técnica, y cómo identificar, y superar, algunos de los problemas más comunes encontrados en un experimento de este tipo.

Protocol

El mantenimiento y la experimentación de animales se llevó a cabo en instalaciones experimentales certificadas y siguió la legislación nacional portuguesa (DL 113/2013) bajo licencia de “grupo-1” por la Dirección General Veterinaria del Ministerio de Agricultura, Desarrollo Rural y Pesca de Portugal. Dado que este protocolo implica el manejo de animales, tiene que ser aprobado por el organismo local y/o nacional que regula el bienestar de los animales utilizados en experimentos científicos, además los investigadores necesitan tener la formación adecuada y licencias para llevar a cabo dichos procedimientos. 1. Preparación de estímulo NOTA: La mayoría de los peces tienen un sistema olfativo altamente sensible, por lo que se debe tener mucho cuidado al preparar los estímulos olfativos que se utilizarán en el experimento. La cristalería utilizada para componer los estímulos debe lavarse en 5% de lejía (hipoclorito de sodio), enjuagarse bien con agua del grifo y secarse. Inmediatamente antes de usar enjuague bien la cristalería con agua de mar (el mismo agua utilizada para hacer las diluciones del estímulo). Tenga cuidado de que ninguna de esta agua entre en contacto con la piel desnuda. Hacer 100 mL de 10-2 M L-glutamina, L-leucina y L-serina; almacenar 1 ml de alícuotas de cada una a -20 oC hasta su uso. El día del experimento, preparar a partir de estas alícuotas, 10-3 M a 10-7 M soluciones (en pasos de dilución x10) utilizando tanto el control como el alto CO2 de agua de mar.NOTA: L-serina (10-3 M) se utilizará como un control positivo, o estándar. El agua utilizada para componer las diluciones de los estímulos, y tratada exactamente de la misma manera que los estímulos pero sin adición de ningún olor, se utilizará como control negativo o en blanco. 2. Preparación de control y agua alta de CO2 Prepare el agua de control recogiendo 1 L de agua de mar filtrada con carbón. Con una sonda de pH, compruebe el pH; debería ser alrededor de 8.2. Si no es así, burbujee con aire atmosférico hasta que se alcance este pH. El uso de un valorador de alcalinidad mide la alcalinidad del agua. Mida la temperatura y la salinidad del agua. Preparar el agua alta deCO2 filtrando 1 L de agua de mar, luego burbujea CO2 hasta que se alcance el pH deseado. Con una sonda de pH, compruebe el pH; debería ser alrededor de 7.7. Usando un valorador de alcalinidad, mida la alcalinidad del agua. Mida la temperatura y la salinidad del agua. Determinar la presión deCO2 tanto en control como en agua deCO2 alta utilizando un software diseñado para calcular los parámetros deCO2 en agua (por ejemplo, el software CO2Calc13). En la ventana de entrada añadir los valores de pH de agua, temperatura, salinidad y alcalinidad total (Figura 1). Seleccione las constantes, unidades y escalas (consulte los valores recomendados en la Figura 2). Pulse el proceso del botón para determinar la presión deCO2.NOTA: La figura 3 muestra un ejemplo de una hoja de resultados. 3. Preparación de los peces NOTA: En este protocolo se utiliza una dorada de 200 a 400 g. Anestesiar la byimmersión del pescado en agua de mar natural aireada que contiene MS222 (sal de metanzoato de etil-3-aminobenzoato). Cuando la respuesta a un pellizco de cola se ha detenido, inyectar en el músculo del flanco el bloqueador neuromuscular de gallamine triethiodide (10 mg kg-1 en solución salina fisiológica).NOTA: La concentración de anestésicos utilizados varía según las especies; para una dorada de 200 a 400 g, utilice 200 mg L-1 tamponado con 400 mg L-1 NaHCO3. Coloque el pescado anestesiado en un soporte acolchado. La forma y el tamaño exactos dependen de las especies modelo; para la dorada (200-400 g), utilice un soporte acolchado en forma de V, hecho en casa. Colocar un tubo de silicio (diámetro 10 mm) en la boca, conectar el tubo a una bomba sumergible en un depósito de agua de mar anestésica, aireada, y bombear agua sobre las branquias a .100mL-min -1kg-1.NOTA: El tamaño del tubo de silicio utilizado dependerá del tamaño del pescado. Inserte el pasador de puesta a tierra en el músculo del flanco y conéctelo a la etapa de la cabeza del amplificador). Cubra el pescado con un paño húmedo (o una toalla de papel) con sólo la cabeza expuesta, asegurándose de que la cubierta no impida la salida de agua de las branquias.NOTA: Los ojos se pueden cubrir con trozos de papel húmedo/ropa o plástico negro. Coloque el tubo del sistema de estimulación-entrega, es decir, el tubo de vidrio conectado a un suministro de agua de mar de fondo, en la fosa nasal.NOTA: Se pueden utilizar tubos de micro-hematocrito (longitud 75 mm, ID a 1,15 mm, OD a 1,55 mm); estos se pueden tirar a un punto más fino en un tirador de electrodos para su uso con peces más pequeños. Es importante asegurarse de que el epitelio olfativo se mantenga húmedo durante la cirugía (descrito a continuación). Exponer los nervios olfativos eliminando la piel y el hueso del cráneo entre los ojos (los nervios olfativos generalmente corren juntos entre los ojos) con la ayuda de un taladro dental (idealmente) o hobby (por ejemplo, Dremel) o pulidor de joyero (con brocas dentales) bajo un microscopio diseccionador (dentro de una jaula de Faraday). En la dorada, retire la parte del cráneo inmediatamente por encima de los ojos, con una sierra circular, desde justo antes hasta los ojos para simplemente posterior a ellos. Luego, usando una broca, retire el hueso entre los ojos; los nervios olfativos se encuentran entre los ojos. Una vez que se ha limpiado suficiente hueso, eliminar la grasa y el tejido conectivo que sobresalía los nervios utilizando fórceps finos; tener cuidado de no dañar los nervios ni perforar ningún vaso sanguíneo.NOTA: La experiencia ayudará a refinar la disección; cuanto menor sea la disección, más estable será la preparación. Sin embargo, se debe limpiar suficiente tejido; para los inexpertos, cuando las bombillas olfativas son sólo visibles, claro un poco más antes para exponer la parte de los nervios a medida que se unen a las bombillas para permitir el posicionamiento correcto de los electrodos. Limpie los electrodos antes de su uso conectándolos al polo negativo de una fuente de 3V DC (por ejemplo, dos baterías AA en serie) y colocando la punta en solución salina fisiológica (o agua de mar diluida 1:3 en agua dulce) durante 20-30 s; una corriente constante de pequeñas burbujas debe ser visto viniendo de la punta. Una vez expuestos los nervios olfativos, inserte los electrodos de grabación (mantenidos en micromantenos) en una posición que dé una respuesta máxima al estándar (por ejemplo, 10-3 M L-serina), y una respuesta mínima al espacio en blanco. Utilice electrodos de tungsteno recubiertos de parileno (Tabla de Materiales) conectados a la etapa de la cabeza de un preamplificador de corriente alterna (CA).NOTA: En la dorada, las respuestas más fuertes a los aminoácidos se ven generalmente con los electrodos colocados en el lado lateral del nervio, cerca de donde se une a la bombilla olfativa. Esto puede ser cierto para otras especies, ya que la organización glomerular de la bombilla es ampliamente similar entre las especies. Sin embargo, la experiencia es siempre el mejor maestro. 4. Registro electrofisiológico NOTA: Al igual que con la mayoría de la electrofisiología, la grabación de varias unidades debe tener lugar dentro de una jaula de Faraday. Sin embargo, la grabación extracelular no suele requerir una tabla antivibración; la mayoría del movimiento vendrá de los peces. Sin embargo, se requiere una mesa fuerte y estable con una superficie metálica para asegurar las bases magnéticas de los soportes de micro-manipuladores. Configure un sistema de administración de estímulo para permitir el cambio rápido de agua de fondo limpia a agua que contenga estímulos, por ejemplo, mediante el uso de una válvula trinóter operada por solenoide. Conecte la salida común al tubo que lleva agua a la roseta olfativa y coloque una línea en un depósito de agua de mar y la otra en la solución de prueba.NOTA: Cuando se cambia la válvula (pasando la corriente continua), el flujo de agua cambia del agua de fondo a la que contiene el olor. El estímulo debe administrarse durante el tiempo suficiente para ver un pico claro en la respuesta integrada, seguido de un período de adaptación; el tiempo utilizado en el protocolo actual es de 4 s, pero puede ser necesario un tiempo más largo dependiendo de la especie. Conecte el controlador de válvula al gatillo de un convertidor analógico-digital (por ejemplo, Digidata); cuando la válvula se cambia de fondo a línea que contiene estímulos, esto iniciará el registro de los datos. Configure el software para iniciar la grabación en el evento de disparo y continúe durante un período predeterminado (por ejemplo, 10 s).NOTA: Diez segundos deben ser suficientes, pero esto se puede acortar o alargar, dependiendo de la pregunta experimental. Compruebe la estabilidad de la preparación probando (registrando y midiendo la amplitud de la respuesta integrada) repetidamente con el estándar, 10-3 M L-seine en este caso, y permitiendo 1 min para transcurrir entre estímulos sucesivos.NOTA: Dependiendo en cierta medida de las especies y los olores, las respuestas deben tener una amplitud dentro del 10% entre sí (como regla general), y deben tener un inicio rápido, elevarse a la actividad máxima y volver a la línea de base después de que el estímulo esté ausente (Figura 4). Registre las respuestas del nervio olfativo a los aminoácidos en el control del agua de mar (de la concentración más baja a la más alta) y permita que transcurra 1 min entre los estímulos sucesivos.NOTA: Es posible que, para algunas especies y/o algunos olores, se necesita más tiempo. Pero para los aminoácidos y la dorada, 1 min es suficiente. Registre la respuesta a 10-3 M de serina y una solución de control en blanco de agua. Cambie el agua de fondo del agua de mar de control a agua de mar deCO2 alta, colocando la línea de fondo en la botella con agua de mar deCO2 alta.NOTA: Es aconsejable insertar otro tubo hematocrito (o equivalente) en el extremo del estímulo y las líneas de fondo para evitar tocar el agua y asegurar que el extremo del tubo permanezca en el agua. Antes de probar la respuesta del nervio olfativo a los aminoácidos en agua de mar deCO2 alta, acondiciona el epitelio olfativo con agua alta deCO2 siguiendo el alto agua deCO2 sobre el epitelio olfativo durante unos minutos.NOTA: La experiencia ha demostrado que, para la dorada, 5 min es suficiente. Registre las respuestas del nervio olfativo a los aminoácidos en el agua de mar deCO2 alta (de la concentración más baja a la más alta). Registre la respuesta a una solución en blanco de agua deCO2 alta. Registre la respuesta a 10-3 M de serina y una solución de control en blanco de agua.NOTA: La señal cruda (actividad nerviosa) debe filtrarse (paso bajo alrededor de 2.000 a 5.000 Hz, paso alto 50 a 300 Hz) y pasar a un convertidor analógico-digital(Tabla de materiales). Para facilitar la cuantificación de la actividad nerviosa, la señal cruda también se puede integrar mediante un integrador con fugas (Tabla de materiales) y pasar al convertidor analógico-digital, y desde allí, tanto señales crudas como integradas a un ordenador que ejecuta el software adecuado (por ejemplo, Axooscopio). 5. Análisis de datos Restar la amplitud de la respuesta integrada al espacio en blanco (en mV) de la amplitud de las respuestas integradas a todos los estímulos. Normalizar las respuestas a los estímulos dividiendo la amplitud de la respuesta anterior a la norma (10-3 M de serina); esto reduce la variabilidad entre peces e intra-peces. Calcular los umbrales de detección por regresión lineal de las curvas de concentración-respuesta (en una gráfica semi-logarítmica), de acuerdo con el registro de fórmula(N + 1.5) – unlog C + B, donde C es la concentración molar, N es la amplitud de respuesta normalizada, y a y b son constantes7,,14.NOTA: El umbral de detección es entonces el valor de x donde y á 0.1761 (es decir, log 1.5; N a 0); la concentración por encima de la cual se verá una respuesta (es decir, el pescado puede olerlo). Algunos olores evocan curvas de concentración-respuesta sigmoidales cuando se trazan semi-logarítmicamente (por ejemplo, calcio15,16; en este caso, los datos normalizados se pueden ajustar a una gráfica Hill de tres parámetros que dará la máxima amplitud de respuesta y la CE50 (es decir, [odorante] que da una respuesta media máxima; también una medida de sensibilidad). Compare los umbrales de detección y/o la amplitud máxima de respuesta y la CE50 de los estímulos probados en agua de control y los probados en agua deCO2 alta.

Representative Results

Una respuesta típica al control positivo (10-3 M L-serina; Figura 4A) y control negativo (en blanco; Figura 4B) registrada a partir del nervio olfativo de una dorada se muestra en la Figura 4. En presencia del estímulo (barra horizontal negra; en la cavidad olfativa, en contacto con el epitelio olfativo), observe el rápido aumento de la actividad (reflejado en la desviación ascendente de la señal integrada) a un pico dentro de aproximadamente un segundo de inicio del estímulo, seguido de un período de adaptación (mientras el estímulo todavía está presente), y un retorno a la actividad de referencia una vez que el estímulo ha terminado. La amplitud absoluta de la respuesta depende en gran medida de la posición del electrodo; si se registra una respuesta de baja amplitud, intente cambiar las posiciones de los electrodos. Un aumento más lento a la actividad máxima puede deberse a que el tubo que transporta el agua que contiene el estímulo al epitelio olfativo que se coloca demasiado lejos del epitelio; tratar de mover el tubo nasal más cerca (pero no tocar) el epitelio. Tenga en cuenta que, en cambio, el espacio en blanco evoca poca o ninguna respuesta. Una respuesta positiva significativa (es decir, aumento de la actividad) al espacio en blanco puede indicar la contaminación del agua utilizada para hacer las diluciones de los estímulos; hacer diluciones frescas con agua limpia (y cristalería) debe resolver esto. De lo contrario, puede ser necesaria una limpieza más exhaustiva del sistema de agua (incluidos los filtros de carbón activado). Una respuesta negativa (es decir, disminución de la actividad) puede indicar un ligero cambio en el caudal cuando se cambia la válvula debido, por ejemplo, a un bloqueo en la válvula. En la Figura 5AA se muestra una curva típica de concentración-respuesta (trazada semi-logarítmicamente), en este caso a L-leucina(10 -7 M a10 -3 M). Tenga en cuenta que el aumento de las concentraciones del olor evoca aumentos cada vez más grandes de la actividad y, por lo tanto, en la amplitud de las respuestas integradas. En la Figura 5Bse muestra una gráfica de los datos normalizados y su correspondiente regresión lineal. El umbral estimado de detección se puede calcular a partir del valor de x cuando y es 0,1761 (es decir, log1,5; donde N es 0). En este caso, este valor es -7.48; es decir, el umbral calculado para L-leucina en este pez es de 10-7,48 M. Del mismo modo, el exponente se puede estimar a partir de la regresión lineal de los datos normalizados en una gráfica de registro-log; logN á élog[odorant] + constante. A continuación, el factor , da el aumento en la concentración de olores necesario para aumentar la amplitud de respuesta en una unidad de registro; es decir, es una estimación de la pendiente de la curva de concentración-respuesta17. En este ejemplo, en el valor de 0,277 y de 3,61 euros, de los números 3,61; por lo tanto, para aumentar la amplitud de respuesta diez veces (es decir, una unidad de registro; log10 a 1), la concentración de estímulo debe aumentarse en 103,61veces (4.074 veces). Enla Figura 6Bse muestra una curva típica de concentración-respuesta sigmoidal ( Figura 6A) cuando se traza semi-logarítmicamente, en este caso a L-glutamina. Se observa un aumento similar dependiente de la concentración en la amplitud de respuesta; sin embargo, en las concentraciones más altas, este aumento se vuelve menor de modo que la amplitud de respuesta alcanza un máximo (Nmáx.). Esto permite que los datos se ajusten a una ecuación Hill de tres parámetros: De esta manera, se pueden calcular las CE50 (la concentración de olores a la que se evoca una respuesta máxima del 50%) y la Hill coeficiente (una medida de la pendiente de la pendiente de la parte lineal de la curva sigmoideal). Figura 1: Captura de pantalla de software que muestra la ventana de entrada del programa CO2Calc. Resaltado (cuadros rojos) son los campos necesarios para el cálculo de parámetros de carbonato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Captura de pantalla de software que muestra la ventana de entrada para las constantes, unidades y escalas adecuadas. Los valores mostrados se recomiendan para las condiciones en las que se llevaron a cabo los experimentos descritos; pueden cambiar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Captura de pantalla de software que muestra la ventana de resultados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Respuestas típicas de varias unidades registradas extracelularmente a partir del nervio olfativo de la dorada in vivo en respuesta a 10-3 M L-serina (A) y en blanco (B). Las trazas superiores muestran las respuestas integradas y las trazas inferiores muestran la señal cruda (nervio). Se aplicaron estímulos al epitelio olfativo (barras horizontales). Tenga en cuenta el rápido aumento de la actividad durante la 1 s de exposición, un pico de actividad, seguido de un período de alojamiento (mientras que el olor todavía se entregó al epitelio) y un retorno a los niveles basales una vez que el parto de olor ha cesado. Poco o ningún aumento de la actividad se observa después de la estimulación con agua tratada de la misma manera que las diluciones de olores, con la excepción de añadir cualquier olor (en blanco). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Curva típica de concentración-respuesta para L-leucina registrada extracelularmente del nervio olfativo in vivo. (A) A medida que la concentración de L-leucina aplicada al epitelio olfativo (barras horizontales) aumenta de 10-7 M a 10-3 M, se observa un aumento concomitante de la actividad en el nervio. Las trazas superiores muestran las respuestas integradas y las trazas inferiores muestran la señal cruda (nervio). (B) Regresión lineal (R2 a 0,97) de los datos normalizados trazados semi-logarítmicamente para calcular el umbral de detección como el valor de log[L-leucina] cuando log(N + 1.5) a 0.1761 (es decir, donde N a 0). En este ejemplo, este valor es -7.48; el umbral estimado de detección de L-leucina en este pez es por lo tanto 10-7.48 M. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Curva típica de concentración-respuesta para L-glutamina registrada extracelularmente del nervio olfativo in vivo. (A) A medida que la concentración de L-glutamina aplicada al epitelio olfativo (barras horizontales) aumenta de 10-7 M a 10-3 M, se observa un aumento concomitante de la actividad en el nervio. Las trazas superiores muestran las respuestas integradas y las trazas inferiores muestran la señal cruda (nervio). (B) Gráfica semi-logarítmica de los datos normalizados instalados en una ecuación de colina de tres parámetros (R2 a 0,99). En este ejemplo, el ECcalculado 50 a 3,11 m, y el co-eficiente de la colina a 0,565). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El estudio actual describe el uso de la grabación multi-unidad (extracelular) del nervio olfativo de la dorada (S. aurata), un sparid marino de gran importancia en la acuicultura. Sin embargo, este enfoque experimental puede aplicarse ampliamente a otros peces; la cirugía y la colocación exacta de los electrodos dependerá claramente de la anatomía del sistema olfativo, y la elección y concentración del anestésico puede depender de la especie en estudio. Por ejemplo, el nervio olfativo del pez dorado (Carassius auratus) es corto; en este caso, grabar el EEG desde la bombilla olfativa sería más fácil. La elección del olor también puede depender, en cierta medida, de la especie. El estudio actual utilizó aminoácidos. Por lo que los autores saben, todas las especies de peces investigadas hasta la fecha tienen sensibilidad olfativa a los aminoácidos1,18. Esta sensibilidad ha sido implicada en diversos procesos como la localización de alimentos, la comunicación química y el reconocimiento de aguas natales19,,20,,21,,22,,23. Sin embargo, las sensibilidades de diferentes especies son, en términos generales, bastante similares y no dependen del estilo de vida o hábitat. También son moléculas bien definidas y son baratas y fácilmente disponibles. Estas razones las convierten en estímulos de prueba ideales para estudios sobre la olfacción en peces, especialmente aquellos que investigan los efectos de las alteraciones antropogénicas (por ejemplo, acidificación o contaminación), donde los resultados se pueden comparar fácilmente entre las especies24.

Dependiendo de la especie en cuestión, los preparativos para el registro multi-unidad pueden permanecer estables durante varias horas; la amplitud de la respuesta a la norma interna (10-3 M L-serina en el estudio actual) no debe variar en más del 10% entre pruebas sucesivas. Cualquier desviación significativa de esta regla general podría deberse a: (i) el movimiento de los peces y, por lo tanto, el desplazamiento de los electrodos y/o tubo nasal; (ii) la contaminación del agua, por ejemplo, al entrar en contacto con las manos del experimentador (especialmente si las concentraciones más bajas de un olor determinado dan respuestas mayores que las concentraciones más altas); o (iii) deterioro de la salud de la preparación). En caso de i), se debe comprobar que el pescado se ha movido; si es así, reposicionarlo, y añadir más anestésico al agua y / o dar otra dosis de trietídido de galamina. Espere 5 minutos y vuelva a probar el estándar. Si la respuesta es aún más pequeña, vuelva a colocar los electrodos y/o el tubo de la nariz hasta que se registre una respuesta suficientemente grande. En caso (ii), simplemente rehaga una serie de dilución fresca del olor, utilizando cristalería limpia y agua. En caso (iii), compruebe que el flujo de agua sobre las branquias del pez es adecuado, que el agua fluye sobre las branquias (es decir, saliendo a través del opercula, en lugar de la boca), y el agua está bien aireada. Diferentes especies de peces tienen preferencias de temperatura muy diferentes; asegurar que la temperatura del laboratorio (y la del agua en contacto con el pescado) esté lo más cerca posible de la temperatura en la que se mantienen los peces. Asegúrese, también, de que los peces no están estresados, y evite moverlos (incluso de un tanque a otro) durante al menos una semana antes de la grabación. El ruido eléctrico es, por supuesto, la ruina de la vida de un electrofisiólogo; sin embargo, el artículo actual no es el medio adecuado para discutir cómo superar/reducir esto. Sin embargo, ‘The Axon Guide’ (disponible gratuitamente en formato pdf para su descarga desde el sitio web del fabricante) es una fuente de consejos prácticos sobre la minimización del ruido. Una vez que un estímulo estándar evoca una respuesta grande y estable, y una serie de concentración da un aumento de amplitud dependiente de la concentración, con una respuesta mínima al espacio en blanco, el registro de respuestas a los estímulos de prueba puede comenzar. Algunos autores dan el mismo estímulo tres veces y calculan la media aritmética para el análisis de datos posterior. Sin embargo, se trata de réplicas técnicas, y este enfoque aumentará el tiempo que tarda tres veces una sesión de grabación. Los autores actuales prefieren probar un olor determinado una vez, pero siempre parte de una curva de concentración-respuesta. Esto no sólo permite el cálculo del umbral de detección o CE50 (como se describe), sino que también garantiza que se prueben concentraciones cercanas a las que los peces experimentarían en su entorno natural (esto no siempre se sabe). Además, cualquier respuesta atípico, debido a la contaminación, por ejemplo, es más fácil de detectar; estos pueden repetirse utilizando una muestra recién hecha si es necesario.

La grabación multi-unidad desde el nervio olfativo puede ser invasiva, pero es más sensible que el EOG cuando se registra en el agua de mar7,ya que es independiente de la salinidad externa. Por lo tanto, puede utilizarse para evaluar la sensibilidad olfativa a los olores, como el calcio y el sodio, cuyos cambios en las concentraciones también afectarían a la conductividad y, en consecuencia, a las tensiones registradas15. Como una estimación del número de ORN que responden a un olor dado (es decir, potenciales de acción que viajan a lo largo de los axones ORN desde el epitelio olfativo hasta la bombilla), representa una señal cruda y sin procesar (el procesamiento inicial de la entrada olfativa comienza en las bombillas). Por lo tanto, es un mejor parámetro para evaluar los efectos directos de los contaminantes, como los metales pesados, y los cambios ambientales, como el pH, en el sistema olfativo que el EOG o el EEG24,,25. El registro de la bombilla olfativa en agua de mar con alto PCO2 (y por lo tanto bajo pH) puede verse afectado por los efectos centrales del pH en el procesamiento neuronal; la ‘teoría del receptor GABAA’ de la acidificación oceánica26,por la cual la reducción del pH del agua provoca una redistribución de Cl– y HCO3– ion en el CSF y un consiguiente cambio de activación GABAérgica de inhibitorio (hiperpolarizante) a excitatorio (despolarizante). Además, en tales estudios, es importante evaluar los efectos de la acidificación o contaminantes utilizando concentraciones de olores similares a las que el pez es probable que encuentre en su entorno natural. Para los aminoácidos, esto es en el rango nano a micromolar27,28,29; cerca del umbral de detección de estos compuestos en los peces1,,18. La estimación del umbral de detección de un olor determinado puede dar una idea de la importancia y/o el papel biológico de la sensibilidad olfativa. Por ejemplo, la lamprea de mar (Petromyzon marinus) tiene una alta sensibilidad olfativa a los ácidos biliares específicos liberados por larvas hasta un umbral de 10-13 M30; esta sensibilidad permite a los adultos localizar e identificar los terrenos de desove adecuados, y por lo tanto actuar como una feromona migratoria a larga distancia. Del mismo modo, la lamprea de mar femenina madura tiene alta sensibilidad olfativa a la esperma (umbral 10-14 M), una poliamina liberada en la milt por los machos, que luego los atrae a los nidos de machos esperma31. Otros peces también tienen sensibilidad olfativa a las poliaminas32,33,34,35, pero no con umbrales suficientemente bajos de detección para apoyar un papel feromonar similar; en cambio, se sugiere evitar peces en descomposición. Sin embargo, con sensibilidades olfativas tan elevadas, es posible imaginar que una ligera reducción de la sensibilidad (es decir, aumento de umbral), incluso cuando la amplitud de respuesta no se reduce drásticamente, podría causar graves problemas para los peces24.

Cuando se trazan semi-logarítmicamente, las curvas de concentración-respuesta a los olores pueden ser exponenciales, lineales o sigmoidales18. En el caso de los aminoácidos, tales curvas semi-logarítmicas de concentración-respuesta son lineales (es decir, logarítmicas), sigmoideales o funciones de potencia7. Que no se observa saturación de la respuesta (es decir, ninguna meseta en la curva de concentración-respuesta, incluso en concentraciones supraambiencentes) se debe probablemente a varios receptores que se unen a aminoácidos individuales, dependiendo de su concentración, en lugar de cada unión de aminoácidos a un receptor específico; a medida que aumenta la concentración de un aminoácido dado, más receptores son capaces de unirlo y por lo tanto responder. Sin embargo, los peces pueden distinguir entre mezclas de aminoácidos36,37,38,39; esto es probable debido a patrones combinatorios de actividad evocados en las bombillas olfativas12,40; los axones de todos los ORN que expresan la misma proteína receptora terminan en el mismo glomérulo en los bulbos olfativos41,42, y un aminoácido puede activar más de un glomeróbulo.

Sin embargo, los olores muy específicos, como las feromonas, pueden evocar curvas de concentración-respuesta sigmoidales o cuasi-sigmoidales43,44. La inferencia, aunque no se prueba empíricamente, es que estas respuestas olfativas se deben a receptores muy específicos que unen la molécula de feromona y poco más. Por lo tanto, por encima de una concentración dada, todos los receptores están ocupados, y los aumentos adicionales no evocarán más respuestas en otros ORN. Por lo tanto, estos datos se pueden instalar en una gráfica Hill de tres parámetros, y la respuesta máxima, EC50 y Hill coeficiente se pueden calcular15,45,46. Esto puede dar información valiosa, como la afinidad aparente y el número aparente del receptor, que las curvas lineales o exponenciales de concentración-respuesta no pueden dar.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El trabajo en el laboratorio de autores cuenta con el apoyo de la Fundación para la Ciencia y la Tecnología (FCT), Portugal, los proyectos PTDC/BIA-BMA/30262/2017 y UID/Multi/04326/2019 y el programa de contratos DL57/2016/CP1361/CT0041 a ZV.

Materials

AC pre-amplifier Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) NL104 Neurolog pre-amplifier specifically designed for this type of recording.
Digidata Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA) 1440A Analogue-digital converter.
EMG Integrator Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) NL703 Leaky' electrical integrator to integrate raw activity of the nerve.
Faraday cage Made in-house To reduce electrical noise.
Filter Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) NL125/6 Filter module for electrophysiological recording.
Gallamine triethiodide Sigma-Aldrich (Portugal) G8134 Neuromuscular blocker
L-glutamine Sigma-Aldrich (Portugal) G3126 Amino acid used as odorant
L-leucine Sigma-Aldrich (Portugal) L80000 Amino acid used as odorant
L-serine Sigma-Aldrich (Portugal) S4500 Amino acid used as odorant
Metalic base-plate Any Provides base for micro-manipulators.
Micro-hematocrit tubes Any To position water supply to the olfactory epithelium
Micro-manipulators Narishige International Ltd (London, UK) M-152 Position electrodes
MS222 (ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt) Sigma-Aldrich (Portugal) E10505 Anesthetic
pH probe Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) HI12302 Probe to measure pH of water.
Refractometer Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) HI96822 Refractometer to measure water salinity
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Portugal) 746398 For saline solution
Solenoid valves The Lee Co. (Essex, CT, USA) LFAA1201618H For switching between background water and stimuus solutions (no longer available)
Stereo-microscope Zeiss, Leica, Olympus Any suitable model. For dissection and placement of electrodes.
Titrator Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) HI84531 Titrator to measure water alkalinity, pH and temperature.
Tungsten micro-electrodes 0.1 MΩ World Precision Instruments (Hitchin, UK) TM31A10 Extracellular electrodes.
Valve Driver Made in-house 12 V DC source for operating solenoid valves.
Water pump (submersible) Any To supply anesthetic-containing water to the gills of the fish.
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Hubbard, P., Velez, Z. Extracellular Multi-Unit Recording from the Olfactory Nerve of Teleosts. J. Vis. Exp. (164), e60962, doi:10.3791/60962 (2020).
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