テレオストの嗅覚神経からの細胞外多単位記録

動物の維持と実験は認定実験施設で行われ、ポルトガルの農業農村開発水産省獣医総局による「グループ1」ライセンスの下でポルトガルの国の法律(DL 113/2013)に従いました。このプロトコルは動物の取り扱いを伴うため、科学的実験に使用される動物の福祉を規制する地方および/または国の機関によって承認されなければならない。 1. 刺激準備 注:ほとんどの魚は非常に敏感な嗅覚システムを持っているので、実験で使用される嗅覚刺激を準備する際に細心の注意を払う必要があります。刺激を補うために使用されるガラス製品は、5%漂白剤(次亜塩素酸ナトリウム)で洗浄し、水道水で十分に洗い流し、乾燥させる必要があります。使用する直前に、海水(刺激希釈を行うために使用されるのと同じ水)でガラス製品を十分に洗い流します。この水のどれも裸の皮膚に接触しないのに注意してください。 10-2 M L-グルタミン、L-ロイシン、L-セリンの100 mLを作ります;使用するまで-20 °Cで各々の1mLのアリコートを保管してください。 実験の当日に、これらのアリコートから、制御と高CO2海水の両方を用いて10-3 M〜10-7 M溶液(x10希釈のステップで)を調製する。-7注: L-セリン (10-3 M) は正のコントロール、または標準として使用されます。刺激の希釈を構成するために使用される水は、刺激とまったく同じ方法で処理されるが、臭気を添加することなく、陰性対照またはブランクとして使用される。 2. 制御と高CO2水の調製 炭を濾過した海水を1L回収して、制御水を準備します。 pH プローブを使用して、pH をチェックします。それは約8.2でなければなりません。もしそうでなければ、このpHに達するまで大気で泡立つ。 アルカリ性の滴定器を用いて、水のアルカリ度を測定する。 水温と水分量を測定します。 海水1Lをろ過して高CO2 水を調製し、その後、所望のpHに達するまでCO2 を泡立て。 pH プローブを使用して、pH をチェックします。7.7前後であるはずです。 アルカリ性滴定器を用いて、水のアルカリ度を測定する。 水温と水分量を測定します。 水中のCO2パラメータを計算するように設計されたソフトウェアを使用して、制御水と高CO2水の両方でCO2圧力を決定します(例えば、CO2Calcソフトウェア213)。 入力ウィンドウに、水pH、温度、アルカリ度、総アルカリ度の値を加算します(図1)。 定数、単位、およびスケールを選択します ( 図 2の推奨値を参照)。 ボタン プロセス を押して、CO2 圧力を決定します。注: 図 3 は 、結果シートの例を示しています。 3. 魚の準備 注: このプロトコルでは、200-400 g の海のブリームが使用されます。 MS222(エチル-3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩)を含む気泡天然海水中で魚を浸漬して麻酔します。尾のピンチへの応答が停止したら、神経筋ブロッカーギャラミントリエチオ化物(生理食塩水中10mg·kg-1) を脇腹筋に注入する。注:使用される麻酔薬の濃度は種によって異なります。シーブリーム 200-400 g の場合、200 mg を使用してください。L-1 400 mgでバッファリング·L-1 ナフコ3. 麻酔魚をクッション付きのサポートの上に置きます。正確な形状とサイズはモデル種によって異なります。シーブリーム(200-400 g)の場合は、埋め込まれたV字型のサポートを使用します。 シリコンチューブ(直径=10mm)を口の中に入れ、麻酔薬含有、通気海水の貯留部の水中ポンプにチューブを接続し、エラの上に水をポンプで覆い、〜100 mL·min-1·kg-1で送ります。-1注:使用するシリコンチューブのサイズは、魚の大きさによって異なります。 接地ピンを側面の筋肉に挿入し、アンプのヘッドステージに接続します)。 魚を湿った布(またはペーパータオル)で覆い、頭だけを露出して、覆いがエラからの水の出口を妨げないようにします。注:目は湿った紙/布または黒いプラスチックで覆うことができます。 刺激送電システムのチューブ、すなわち、背景海水の供給に接続されたガラス管を鼻孔に位置付ける。注:マイクロヘマトクリットチューブ(長さ = 75ミリメートル、ID = 1.15ミリメートル、OD = 1.55ミリメートル)を使用することができます。これらは、より小さな魚で使用するために電極引き手の上のより細かい点に引っ張ることができます。手術中に嗅上皮が濡れ保たれていることを確認することが重要です(後述)。 目の間の頭蓋骨の皮膚と骨(通常は目の間で一緒に走る嗅覚神経)を、解剖顕微鏡(ファラデーケージ内)の下で、歯科または趣味(例えば、ドレメル)ドリルまたはジュエラーのポリッシャー(歯科ドリルビット付き)の助けを借りて、嗅覚神経を露出させる。 海のブリームでは、目のすぐ上の頭蓋骨の部分を、円形の鋸で、目の前部から後ろまで取り除きます。次に、ドリルビットを使用して、目の間の骨を取り除きます。嗅覚神経は目の間にある。 十分な骨がクリアされたら、細かい鉗子を使用して神経の上に脂肪と結合組織を取り除きます。神経を傷つけたり、血管を穿刺しないように注意してください。注:経験は解剖を洗練するのに役立ちます。解剖が小さいほど、準備はより安定します。しかし、十分な組織をクリアする必要があります。未経験のために、嗅球がちょうど見えるとき、彼らは電極の正しい位置を可能にするために電球に加わるように神経の一部を露出させるために少し前もってクリア。 使用前に電極を3V DC電源の負極(直列の2つのAA電池)に接続し、20-30 sの生理食塩水(または淡水で1:3希釈した海水)に先端を置くことによって、電極をきれいにします。先端から来る小さな泡の安定した流れを見る必要があります。 嗅覚神経が露出したら、標準(例えば、10-3 M L-セリン)に対して最大の応答を与える位置に記録電極(マイクロマニピュレータに保持)を挿入し、ブランクに対する最小限の応答を挿入します。交流(AC)プリアンプのヘッドステージに接続されたパリレンコーティングタングステン電極(材料表)を使用します。注:海皮では、アミノ酸に対する最も強い応答は、通常、嗅球に結合する場所の近くに、神経の側面に置かれた電極で見られます。球根の糸球体組織は種間で広く類似しているので、これは他の種にも当てはまるかもしれない。しかし、経験は常に最高の教師です。 4. 電気生理学的記録 注:ほとんどの電気生理学と同様に、マルチユニットの記録はファラデーケージ内で行われる必要があります。しかし、細胞外記録は通常、防振テーブルを必要としません。ほとんどの動きは魚から来ます。それにもかかわらず、マイクロマニピュレータースタンドの磁気ベースを固定するために、金属表面を用いて強く安定したテーブルが必要です。 ソレノイド作動式三方弁を用いて、きれいな背景水から刺激含有水への迅速な切り替えを可能にする刺激送達システムを設置する。共通の出口を水を運ぶ管に管を接続し、一方のラインを海水貯留所に、もう一方のラインを試験溶液に置きます。注:バルブが切り替わる場合(DC電流を流すことで)、水の流れは、背景水から臭気を含む水に切り替わります。刺激は、統合された応答の明確なピークを見るのに十分な長さのために与えられ、その後に宿泊施設の期間が続く。現在のプロトコルで使用される時間は4 sですが、種によっては長い時間が必要な場合があります。 バルブドライバをアナログデジタルコンバータ(例えば、Digidata)のトリガに接続します。バルブがバックグラウンドから刺激を含むラインに切り替えられると、データの記録が開始されます。トリガー・イベントで記録を開始し、所定の期間(例えば10 s)まで継続するようにソフトウェアを構成します。注:10秒で十分ですが、実験的な質問に応じて、これを短くしたり長くすることができます。 試験(積分応答の振幅を記録・測定)を標準で繰り返し、この場合は10-3M L-セリン、連続した刺激の間に1分経過させることにより、調製物の安定性を確認する。注:種や臭気のある程度に応じて、応答は(経験則として)互いの10%以内の振幅を持ち、急速な発症を有し、最大の活性に上昇し、刺激が存在しなかった後にベースラインに戻る必要があります(図4)。 コントロール海水中のアミノ酸に対する嗅覚神経応答を記録し(最も低い濃度から最高濃度まで)、連続した刺激の間に1分経過させます。注:いくつかの種および/またはいくつかの臭気のために、より多くの時間が必要である可能性があります。アミノ酸や海鯛の場合は1分で十分です。 10-3 Mセリンと制御水ブランク溶液への応答を記録します。 高CO2海水とボトルに背景線を配置することにより、制御海水から高CO2海水に背景水を変更します。注:水に触れないように、刺激と背景の線の端に別のヘマトクリットチューブ(または同等物)を挿入し、チューブの端が水に残っていることを確認することをお勧めします。 高CO2 海水中のアミノ酸に対する嗅覚神経の応答を試験する前に、嗅上皮上皮上皮上に高CO2 水を数分間にわたって従うことによって、嗅上皮を高CO2 水で条件条件する。注:経験から、海のブリームの場合は5分で十分です。 高CO2 海水中のアミノ酸に対する嗅覚神経応答を記録する(最も低い濃度から最高濃度まで)。 高CO2 水ブランク溶液への応答を記録します。 10-3 Mセリンと制御水ブランク溶液への応答を記録します。注:生信号(神経活動)は、フィルタ(約2,000〜5,000 Hz、ハイパス50-300 Hz)にフィルタリングされ、アナログデジタルコンバータ(材料表)に渡されるべきです。神経活動の定量を容易にするために、生信号は漏れインテグレーター(材料表)を使用して統合され、アナログデジタルコンバータに渡され、そこから、適切なソフトウェア(例えばAxoscope)を実行しているコンピュータに生信号と統合信号の両方を渡すことができます。 5. データ分析 すべての刺激に対する統合応答の振幅から、ブランク(mV)に対する統合応答の振幅を差し引きます。 標準(10-3 Mセリン)に対する以前の応答の振幅を分割することによって刺激に対する応答を正規化する。これにより、魚間および魚内の変動性が低下します。 濃度応答曲線の線形回帰(半対数プロット上)による検出の閾値をb計算し、式ログ(N+1.5)=NログC+B、Cはモル濃度、Nは正規化された応答振幅、aとbは定数7、1414である。7注: 検出のしきい値は xの値でy = 0.1761 (つまり、log 1.5;N = 0);応答が見られる以上の濃度(すなわち、魚はそれを嗅ぐことができます)。一部の臭気は、半対数でプロットするとシグモイド濃度応答曲線を呼び起こす(例えば、カルシウム15、16、この場合、正規化されたデータは3パラメータヒルプロットに適合し、最大応答振幅とEC50(すなわち、半分の最大応答を与える[臭気]および感受性の尺度)を与えることができる。15, 制御水でテストした検出の閾値および/または最大応答振幅とEC50 の刺激と高CO2 水で試験された刺激を比較します。