JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

הקלטה רב-יחידה חוץ-תאית מעצב הריח של טאוסט

Published: October 06, 2020
doi:
10.3791/60962
,
1Centro de Ciências do Mar, 2Universidade do Algarve

Summary

הקלטה רב-יחידה חוץ-תאית מעצב הריח היא שיטה רגישה, איתנה ותו לאופתית להערכת רגישות חוש הריח בדגים ימיים. הוא מתעד קלט חושי ראשי והוא אינו תלוי במליתיות חיצונית.

Abstract

מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי חומציות האוקיינוס משפיעה על התנהגות מונעת חוש הריח בדגים. ייתכן שהיכן כי הבעיה נובעת בחלקה מירידה ברגישות הריח במים PCO2/pH נמוכים. כדי להעריך את ההשפעות של חומציות האוקיינוס, או רגישות חוש הריח בדגים ימיים באופן כללי, אנו מציעים כי הקלטה רב-יחידה חוץ תאית מעצב הריח היא שיטת הבחירה. למרות שהיא פולשנית, היא רגישה, חזקה, רחזורית ובלתי תלויה במליחותיות חיצונית (בניגוד לאלקטרו-אולפקטוגרם [EOG], למשל). יתר על כן, הוא מתעד קלט חושי ראשי לתוך CNS, לפני כל עיבוד מרכזי. אנו מראים כי שיטה זו יכולה להראות ירידה ברגישות ריח כי הוא גם זמני ותלוי ריח, באמצעות מגוון של חומצות אמינו כדי לבנות עקומות תגובת ריכוז ולחשב את סף הזיהוי.

Introduction

דגים מסתמכים במידה רבה על olfaction עבור היבטים רבים של חייהם כולל מציאת מזון, הימנעות טורפים, הערכת בניזוג פוטנציאליים הגירה, בין היתר 1,,2,,3. לכן, הערכת רגישות חוש הריח בדגים (מה הם מריחים? עד כמה הם רגישים לתרכובות אלה?) חיוני כדי להבין תהליכים אלה באופן מלא. יתר על כן, השפעות אנתרופוגנית על הסביבה, כגון חומציות האוקיינוס וזיהום, עשויות להיות השפעות עמוקות על מערכת הריח, אפילו ברמות sublethal, כי זה בהכרח במגע אינטימי עם המים שמסביב4. ב-vivo electrophysiology היא הגישה הניסיונית של בחירה להעריך את רגישות חוש הריח בדגים. שלוש טכניקות עיקריות זמינות: אלקטרו-olfactogram (EOG), אלקטרו-אנצפלוגרם (EEG) הוקלט מנורת הריח, והקלטה מרובת יחידות מעצבהריח 5.

EOG הוא הנפוץ ביותר של אלה שלושה6. זהו פוטנציאל שדה זרם ישיר (DC) נרשם מעל אפיתל חוש הריח והוא האמין להיות פוטנציאל גנרטור מסוכם של נוירונים קולטן ריח (ORNs) מגיב ריח נתון. עם זאת, כפי שהוא נרשם במים, ולא בתוך הדג, משרעת התגובה תלויה לא רק באות שנוצר על ידי הדגים, אלא גם ב מוליכות המים שמסביב; כך המשרעת תהיה נמוכה יותר בהו מוליכות (או ההתנגדות נמוכה יותר). משמעות הדבר היא כי EOG היא שיטה פחות רגישה במי ים מאשר מים מתוקים7.

EEG הוקלט מנורת הריח הוא גם בשימוש נרחב בחקירת הריח בדגים. עם זאת, הנורה חוש הריח הוא מרכז עיבוד סדר ראשון עבור קלט חוש הריח8; הוא מאורגן מאוד לתוך glomeruli, וכתוצאה מכך התגובה שהוקלטה תלויה במידה רבה במיקום של אלקטרודות ההקלטה. לדוגמה, הקלט מ- ORNs המזהה חומצות אמינו מעובד על ידי glomeruli באזור לחוץ של נורות חוש הריח, ואילו כי מכימיקלים נגזרים conspecific מופנה לאזור מדיאלי9,10,11,12. קלט פרומונים עשוי להיות מופנה glomeruli מקומי מאוד בתוך הנורה חוש הריח. בהתאם גם לאנטומיה של המין המדובר, מיקום ההקלטה האידיאלי עבור ריח נתון לא יכול להיות נגיש בקלות.

הקלטה מרובת יחידות מעצב הריח עוקפת את הבעיות העיקריות עם EOG ו- EEG המתואר לעיל. כפי שהוא מתעד פעולות פוטנציאל עובר את האקסונים של ORNs מהאפיתל לנורה, זה אות חושי ראשי. ומזמן שהיא מוקלטת בתוך הדג, משרעת התגובה אינה תלויה במליתיות חיצונית. אף על פי כן, כמובן שיש לו כמה חסרונות. ראשית, בהתאם לאנטומיה של המין, נדרש ניתוח נרחב יותר כדי לחשוף את עצב הריח מאשר עבור EOG. שנית, מכיוון שהאות קטן יותר מה-EOG, הוא דורש ציוד מעט יותר מתוחכם, ולכן יקר. תיאור כללי של גישות ניסיוניות אחרות ניתן על ידי ג’ון קפריו5. מטרת מאמר זה היא לפרט כיצד לתעד תגובות רב-יחידות חוץ-תאיות מעצב הריח של הים (Sparus aurata) ב vivo כדי חומצת אמינו odorants כדוגמה של טכניקה זו, ואיך לזהות, להתגבר, כמה מהבעיות הנפוצות יותר נתקל בניסוי כזה.

Protocol

תחזוקה וניסויים של בעלי חיים בוצעו במתקנים ניסיוניים מאושרים ועקבו אחר החקיקה הלאומית הפורטוגזית (DL 113/2013) תחת רישיון ‘קבוצה-1’ על ידי המנהל הכללי הווטרינרי, משרד החקלאות, פיתוח כפרי ודיג של פורטוגל. מכיוון שפרוטוקול זה כרוך בטיפול בבעלי חיים, יש לאשר אותו על ידי הגוף המקומי ו/או הלאומי המסדיר את רווחתם של בעלי חיים המשמשים בניסויים מדעיים, בנוסף על החוקרים לקבל את ההכשרה והרישיונות המתאימים לביצוע הליכים כאלה. 1. הכנת גירוי הערה: לרוב הדגים יש מערכת חוש הריח רגישה מאוד, ולכן יש לנקוט בזהירות רבה בעת הכנת גירויי הריח לשימוש בניסוי. כלי הזכוכית המשמשים כדי לפצות את הגירויים יש לשטוף 5% אקונומיקה (נתרן hypochlorite), שטף ביסודיות עם מי ברז מי מי מיבש. מיד לפני השימוש לשטוף את כלי הזכוכית ביסודיות עם מי ים (אותם מים המשמשים כדי להפוך את דילול הגירוי). תדאג ששום אחד מהמים האלה לא יבוא במגע עם עור חשוף. לעשות 100 מ”ל של 10-2 M L-גלוטמין, L-leucine ו L-serine; לאחסן 1 מיליון aliquots של כל אחד ב -20 °C עד לשימוש. ביום הניסוי, היכונו מאותם aliquots, 10-3 M עד 10-7 M פתרונות (בשלבים של דילול x10) באמצעות שליטה ומי ים CO2 גבוהים.הערה: L-serine(10-3 M) ישמש כפקד חיובי, או כסטנדרט. מים המשמשים כדי לפצות את דילול הגירויים, וטופלו בדיוק באותו אופן כמו הגירויים אבל ללא תוספת של כל ריח, ישמש שליטה שלילית או ריק. 2. הכנת שליטה ומי CO2 גבוהים הכן את מי הבקרה על ידי איסוף 1 L של מי ים מסוננים פחם. באמצעות בדיקת pH, בדוק את ה-pH; זה צריך להיות בסביבות 8.2. אם לא, בועה עם אוויר אטמוספרי עד pH זה מגיע. באמצעות טיטרטור אלקליות למדוד את האלקליות של המים. למדוד את טמפרטורת המים ואת המלוהות. הכן מים CO2 גבוה על ידי סינון 1 L של מי ים, ולאחרמכן בועה CO 2 עד pH הרצוי הוא הגיע. באמצעות בדיקת pH, בדוק את ה-pH; זה צריך להיות בסביבות 7.7. באמצעות טיטרטור אלקליות, למדוד את האלקליות של המים. למדוד את טמפרטורת המים ואת המלוהות. לקבועלחץ CO 2 הן שליטה ומים CO2 גבוה באמצעות תוכנה שנועדה לחשב פרמטרים CO2 במים (למשל, CO2Calcתוכנה 13). בחלון הקלט להוסיף את הערכים של pH מים, טמפרטורה, ממליחות ואלקליות מוחלטת(איור 1). בחר את הקבועים, היחידות וקנה המידות (ראה את הערכים המומלצים באות 2). לחץ על תהליך הלחצן כדי לקבוע לחץ CO2.הערה: איור 3 מציג דוגמה של גליון תוצאות. 3. הכנת הדגים הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש ב- 200-400 גרם. להמם את דגי byimmersion במי ים טבעיים aerated המכיל MS222 (אתיל-3-aminobenzoate מלח מתנסולפונט). כאשר התגובה צביטה זנב נעצר, להזריק לתוך שריר האגף את החוסם הנוירו-שרירי גלאמין triethiodide (10מ”ג·ק”ג -1 בתמיסת מלח פיזיולוגית).הערה: ריכוז ההרדמה בשימוש משתנה בין מינים; עבור 200-400 גרם, השתמש ב- 200 מ”ג· L-1 אגירה עם 400 מ ג· L-1 NaHCO3. מניחים את הדג המהרסם על תמיכה מרופדת. הצורה והגודל המדויקים תלויים במין המודל; עבור seabream (200-400 גרם), השתמש בתמיכה מרופדת בצורת V, מצורה בבית. מניחים צינור סיליקון (קוטר = 10 מ”מ) בפה, לחבר את הצינור למשאבה צוללת במאגר של חומרי הרדמה, מי ים aerated, ומשאבת מים מעל הזימים ב ~ 100 mL·min-1· ק”ג-1.הערה: גודל צינור הסיליקון המשמש יהיה תלוי בגודל הדג. הכנס את סיכת ההשתה לשריר האגף וחבר אותה לשלב הראש של המגבר). מכסים את הדג במטלית לחה (או מגבת נייר) כשראשו חשוף בלבד, ומוודאים שהכיסוי אינו מסב את יציאת המים מהזימים.הערה: העיניים יכולות להיות מכוסות בחתיכות נייר/בד לחים או פלסטיק שחור. מקם את הצינור של מערכת אספקת הגירויים, כלומר, צינור הזכוכית המחובר לאספקת מי ים ברקע, לתוך נחיר.הערה: ניתן להשתמש בצינורות מיקרו-המטוקריט (אורך = 75 מ”מ, מזהה = 1.15 מ”מ, OD = 1.55 מ”מ); אלה יכולים להסתגר לנקודה עדינה יותר על מושך אלקטרודה לשימוש עם דגים קטנים יותר. חשוב לוודא כי אפיתל חוש הריח נשמר רטוב במהלך הניתוח (מתואר להלן). לחשוף את עצבי הריח על ידי הסרת העור והעצם של הגולגולת בין העיניים (עצבי הריח בדרך כלל לרוץ יחד בין העיניים) בעזרת שיניים (אידיאלי) או תחביב (למשל, דרמל) מקדחה או מלטש תכשיטן (עם מקדח שיניים חתיכות) תחת מיקרוסקופ לנתח (בתוך כלוב פאראדיי). בבריאם הימי, הסר את החלק של הגולגולת מיד מעל העיניים, עם מסור עגול, מהחלק הקדמי לעיניים רק לחלק האחורי אליהם. לאחר מכן, באמצעות מקדח, להסיר את העצם בין העיניים; עצבי הריח נמצאים בין העיניים. לאחר עצם מספיק נוקה, להסיר את רקמת השומן והחיבור מעל העצבים באמצעות ממחשוף פיין; לדאוג לא לפגוע בעצבים או לנקב כל כלי דם.הערה: הניסיון יסייע למקד את הפירוק; קטן יותר, ההכנה תהיה יציבה יותר. עם זאת, יש לנקות רקמה מספקת; עבור חסרי ניסיון, כאשר נורות חוש הריח הם פשוט גלויים, ברור קצת יותר קדמי לחשוף את החלק של העצבים כפי שהם מצטרפים הנורות כדי לאפשר את המיקום הנכון של האלקטרודות. נקה את האלקטרודות לפני השימוש על-ידי חיבורן לקוטב שלילי של מקור DC 3V (לדוגמה, שתי סוללות AA בסדרה) והצבת הקצה בתמיסת מלח פיזיולוגית (או מדוללת מי ים 1:3 במים מתוקים) עבור 20-30 שניות; זרם קבוע של בועות קטנות יש לראות מגיע מהקצה. לאחר חשיפה של עצבי הריח, הכנס את אלקטרודות ההקלטה (המוחזקות על מיקרו-מניפולטורים) בתנוחה המעניקה תגובה מקסימלית לתקן (לדוגמה,10-3 M L-serine) ותגובה מינימלית לריק. השתמש אלקטרודות טונגסטן מצופה פרילן(טבלת חומרים)מחובר לשלב הראש של preamplifier זרם מתחליפים (AC).הערה: ב seabream, התגובות החזקות ביותר חומצות אמינו נראים בדרך כלל עם אלקטרודות ממוקם בצד הצדדי של העצב, קרוב למקום שבו הוא מצטרף הנורה חוש הריח. זה עשוי להחזיק נכון עבור מינים אחרים, כמו הארגון ההנומרי של הנורה דומה באופן נרחב בקרב מינים. עם זאת, ניסיון הוא תמיד המורה הטוב ביותר. 4. הקלטה אלקטרופיזיולוגית הערה: כמו ברוב האלקטרופיזיולוגיה, הקלטה מרובת יחידות צריכה להתקיימה בתוך כלוב פאראדיי. עם זאת, הקלטה extracellular אינה דורשת בדרך כלל טבלה נגד רטט; רוב התנועה תגיע מהדגים. אף על פי כן, שולחן חזק ויציב נדרש עם משטח מתכת כדי לאבטח את הבסיסים המגנטיים של דוכני מיקרו מניפולטור. הקימו מערכת אספקת תמריצים שתאפשר מעבר מהיר ממים נקיים ברקע למים המכילים גירויים, למשל, באמצעות שסתום שלישי המופעל באמצעות סולנואידים. חבר את השקע המשותף לצינור הנושא מים לרוזט הריח, והניח קו אחד במאגר מי ים והשני בתמיסת הבדיקה.הערה: כאשר השסתום מוחלף (על-ידי העברת זרם DC), זרימת המים עוברת ממים ברקע לזה המכיל את ריח ההריח. הגירוי צריך להינתן מספיק זמן כדי לראות שיא ברור בתגובה המשולבת, ואחריו תקופה של לינה; הזמן המשמש בפרוטוקול הנוכחי הוא 4 s, אך ייתכן שיהיה צורך בזמן ארוך יותר בהתאם למין. חבר את מנהל ההתקן של השסתום לגורם המפעיל של ממיר אנלוגי-דיגיטלי (לדוגמה, Digidata); כאשר השסתום מוחלף מרקע לקו המכיל גירוי, כך יתחיל הקלטת הנתונים. הגדר את התוכנה כך שתתחיל להקליט באירוע הגורם המפעיל והמשך לתקופה מוגדרת מראש (לדוגמה, 10 שניות).הערה: עשר שניות אמורות להספיק, אך ניתן לקצר או להאריך זאת, בהתאם לשאלה הניסיונית. בדוק את היציבות של ההכנה על ידי בדיקה (הקלטה ומדידת משרעת התגובה המשולבת) שוב ושוב עם תקן,10 -3 M L-serine במקרה זה, ומאפשר 1 דקות לעבור בין גירויים רצופים.הערה: בהתאם במידה מסוימת על מינים ריח, התגובות צריך משרעת בתוך 10% אחד את השני (ככלל אצבע), וצריך להיות התחלה מהירה, לעלות לפעילות מקסימלית, ולחזור לקו הבסיס לאחר הגירוי חסר(איור 4). להקליט את התגובות עצבי הריח חומצות אמינו בשליטה מי ים (מהנמוך ביותר לריכוז הגבוה ביותר) ולאפשר 1 דקות לעבור בין גירויים רצופים.הערה: ייתכן כי, עבור מינים מסוימים ו / או כמה ריחנים, יותר זמן הוא הכרחי. אבל עבור חומצות אמינו וsinobream, 1 דקות זה מספיק. ריהיה תיעוד התגובהל-10-3 M serine ולפתרון שליטה על מים ריקים. שנה את מי הרקע משליטה במי ים כדי מי ים CO2 גבוהים, על ידי הצבת קו הרקע לתוך הבקבוק עם מי ים CO2 גבוהים.הערה: מומלץ להכניס צינור המטוקריט אחר (או שווה ערך) לסוף הגירוי וקווי הרקע כדי להימנע מלגעת במים ולהבטיח שסוף הצינור יישאר במים. לפני בדיקת התגובה שלעצב הריח לחומצות אמינו במי ים CO2 גבוהים, תנאי האפיתל חוש הריח עם מים CO 2 גבוה על ידי ביצוע מי CO2 גבוה מעל אפיתל חוש הריח במשך כמה דקות.הערה: הניסיון הראה כי, עבור seabream, 5 דקות זה מספיק. להקליט את התגובות עצב הריח חומצות אמינו במי ים CO2 גבוה (מהנמוך ביותר לריכוז הגבוה ביותר). ריהיה זה שתגובה לפתרון מיםדו-קומתי 2 גבוה. ריהיה תיעוד התגובהל-10-3 M serine ולפתרון שליטה על מים ריקים.הערה: יש לסנן את אות הגלם (פעילות עצבית) (מעבר נמוך סביב 2,000-5,000 הרץ, מעבר גבוה 50-300 הרץ) ולעבור ממיר אנלוגי-דיגיטלי(טבלת חומרים). לכמת קל יותר של פעילות עצבית, ניתן לשלב את האות הגולמי גם באמצעות אינטגרטור דולף(טבלת חומרים)ולעבור לממיר האנלוגי-דיגיטלי, ומשם, אותות גולמיים ומשולבים למחשב שבו פועלת התוכנה המתאימה (לדוגמה, Axoscope). 5. ניתוח נתונים להפחית את משרעת התגובה המשולבת ריק (ב mV) מן המשרעת של התגובות המשולבות לכל הגירויים. לנרמל את התגובות לגירויים על ידי חלוקת משרעת התגובה הקודמת לתקן (10-3 M serine); פעולה זו מפחיתה את השונות בין-ו-תוך-דגים. חשב את סף הזיהוי על-ידי רגרסיה ליניארית של עקומות תגובת הריכוז (על חלקה חצי לוגריתמית), על פי יומן הנוסחאות(N + 1.5) =יומן C + B, כאשר C הוא ריכוז הטוחנות, N הוא משרעת תגובה מנורמלת, ו- b הם קבועים 7,14.הערה: סף הזיהוי הוא הערך עבור x שבו y = 0.1761 (כלומר, יומן 1.5; N = 0); הריכוז שמעליו תראה תגובה (כלומר, הדג יכול להריח את זה). כמה ריחנים לעורר עקומות ריכוז-תגובה סיגמואידית כאשר התוויית חצי לוגריתמי (למשל,סידן 15,16; במקרה זה, הנתונים מנורמלים ניתן להיות מותאם ללווים היל שלושה פרמטרים אשר ייתן משרעת התגובה המרבית EC50 (כלומר, [odorant] זה נותן תגובה חצי מקסימלית; גם מידה של רגישות). השווה את סף הזיהוי ו/או את משרעת התגובה המרבית ואתה-EC 50 של גירויים שנבדקו במים בקרה ואלה שנבדקו במים CO2 גבוהים.

Representative Results

תגובה אופיינית לשליטה החיובית(10-3 M L-serine; איור 4A) ופקד שלילי (ריק; איור 4ב’) התיעוד מעצב הריח של ים מוצג באות 4. בנוכחות הגירוי (פס אופקי שחור; בחלל הריח, במגע עם האפיתל הריח), שים לב לעלייה המהירה בפעילות (המשתקפת בהסטה כלפי מעלה של האות המשולב) לשיא בתוך כשנייה אחת של תחילת הגירוי, ולאחר מכן תקופת לינה (בעוד הגירוי עדיין קיים), וחזרה לפעילות בסיסית לאחר סיום הגירוי. המשרעת המוחלטת של התגובה תלויה מאוד במיקום אלקטרודה; אם נרשמת תגובת משרעת נמוכה, נסה לשנות את תנוחות האלקטרודה. עלייה איטית יותר לפעילות שיא עשויה להיות בשל הצינור הנושא את המים המכילים גירוי לאפיתל חוש הריח הממוקם רחוק מדי מן האפיתל; נסה להזיז את צינור האף קרוב יותר (אך לא לגעת) האפיתל. שים לב כי, לעומת זאת, הריק מעורר תגובה מועטה או ללא תגובה. תגובה חיובית משמעותית (כלומר, עלייה בפעילות) לריק עשויה להצביע על זיהום המים המשמשים לדילול הגירויים; ביצוע דילול טרי עם מים נקיים (וכלי זכוכית) צריך לפתור את זה. אם לא, ייתכן שיהיה צורך בניקוי יסודי יותר של מערכת המים (כולל מסנני פחם מופעלים). תגובה שלילית (כלומר, ירידה בפעילות) עשויה להצביע על שינוי קל בקצב הזרימה בעת החלפת השסתום עקב חסימה בשסתום, לדוגמה. עקומת תגובת ריכוז טיפוסית (מתווה חצי לוגריתמי), במקרה זה L-leucine (10-7 M עד 10-3 M),-7 מוצגת באות 5A. שים לב כי הגדלת ריכוזי האודורנט לעורר עליות גדולות יותר ויותר בפעילות, ולכן, במשרעת של התגובות המשולבות. עלילה של הנתונים המנורמלים, והרגרסיה ליניארית המתאימה שלהם, מוצגת באיון 5ב’. ניתן לחשב את סף הזיהוי המשוער מהערך של x כאשר y = 0.1761 (כלומר, log1.5; איפה N = 0). במקרה זה, ערך זה הוא -7.48; כל כך, הסף המחושב עבור L-leucine בדג זה הוא 10-7.48 M. ניתן להעריך באופן דומה את המעריך α מתוך רגרסיה ליניארית של הנתונים מנורמלים על מגרש יומן רישום; יומןN = αlog [odorant] + קבוע. הגורם אז נותן את העלייה בריכוז ריח נדרש כדי להגדיל את משרעת התגובה על ידי יחידת יומן אחת; כל כך, זוהי הערכה של התלולות של עקומת תגובת הריכוז17. בדוגמה זו, α = 0.277 ו- ơ = 3.61; לכן, כדי להגדיל את משרעת התגובה פי עשרה (כלומר, יחידת יומן אחת; log10 = 1), ריכוז הגירוי צריך להיות מוגבר על ידי 103.61-fold (פי 4,074). עקומת ריכוז-תגובה סיגמואידית טיפוסית (איור 6א’)כאשר התווייתו חצי לוגריתמית, במקרה זה ל-L-גלוטמין, מוצגת באות 6ב’. עלייה דומה תלוי ריכוז משרעת תגובה נראה; עם זאת, בריכוזים גבוהים יותר, עלייה זו הופכת פחות כך משרעת התגובה מגיע המקסימום (Nמקסימום). הדבר מאפשר את התאם הנתונים למשוואה של שלושה פרמטרים של Hill: בדרך זו, EC50 (ריכוז ריח שבו 50% תגובה מקסימלית הוא עורר) ואת הגבעה שיתוף יעיל (מדד של התלוליות של המדרון של החלק ליניארי של עקומת סיגמואיד) ניתן לחשב. איור 1: צילום מסך של תוכנה המציג את חלון הקלט מהתוכנית CO2Calc. מסומנים (תיבות אדומות) הם השדות הדרושים לחישוב פרמטר פחמתי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 2: צילום מסך של תוכנה המציג את חלון הקלט עבור הקבועים, היחידות וקנה המידות המתאימים. הערכים המוצגים מומלצים לתנאים שבהם בוצעו הניסויים המתוארים; הם עשויים להשתנות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 3: צילום מסך של תוכנה המציג את חלון התוצאות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 4: תגובות מרובות יחידות אופייניות שהוקלטו באופן חוץ-תאי מעצב הריח של seabream ב vivo בתגובה10-3 M L-serine (A) ריקה (B). עקבות עליון להראות את התגובות המשולבות ועקבות נמוכים להראות את האות גלם (עצב). גירויים הוחלו על אפיתל חוש הריח (פסים אופקיים). שימו לב לעלייה המהירה בפעילות במהלך החשיפה של 1 ס’, שיא בפעילות, ולאחריה תקופת לינה (בעוד האודורנט עדיין נמסר לאפיתל) וחזרה לרמות הבסיס לאחר הפסקת אספקת האודורנט. עלייה קטנה או לא בפעילות נראית בעקבות גירוי עם מים שטופלו באותו אופן כמו דילול ריח, למעט הוספת כל ריח (ריק). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 5: עקומת תגובת ריכוז טיפוסית עבור L-leucine נרשם באופן extracellular מעצב הריח ב vivo. (א)כמו הריכוז של L-leucine מוחל על אפיתל חוש הריח (פסים אופקיים) גדל מ 10-7 M כדי 10-3 M, עלייה במקביל בפעילות נראית בעצב. עקבות עליון להראות את התגובות המשולבות ועקבות נמוכים להראות את האות גלם (עצב). (ב)רגרסיה ליניארית (R2 = 0.97) של נתונים מנורמלים התוווו באופן חצי לוגריתמי כדי לחשב את סף הזיהוי כערך עבור יומן רישום[L-leucine] כאשר יומן(N + 1.5) = 0.1761 (כלומר, כאשר N = 0). בדוגמה זו, ערך זה הוא -7.48; הסף המשוער של זיהוי L-leucine בדג זה הוא ולכן 10-7.48 M. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 6: עקומת ריכוז-תגובה אופיינית עבור L-גלוטמין נרשם באופן חוץ-תאי מעצב הריח ב vivo. (א)כמו הריכוז של L-גלוטמין מוחל על אפיתל חוש הריח (פסים אופקיים) גדל מ 10-7 M כדי 10-3 M, עלייה במקביל בפעילות נראית בעצב. עקבות עליון להראות את התגובות המשולבות ועקבות נמוכים להראות את האות גלם (עצב). (ב)התוויה חצי לוגריתמית של נתונים מנורמלים המותאם למשוואת היל בעלת שלושה פרמטרים (R2 = 0.99). בדוגמה זו, ECמחושב 50 = 3.11 μM, ואת היל שיתוף יעיל = 0.565). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

המחקר הנוכחי מתאר את השימוש בהקלטה רב-יחידה (חוץ-תאית) מעצב הריח של הים (S. aurata), ריד ימי בעל חשיבות רבה בתחומת המים. עם זאת, גישה ניסיונית זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על דגים אחרים; הניתוח והמיקום המדויק של אלקטרודות יהיו תלויים בבירור באנטומיה של מערכת הריח, והבחירה והריכוז של חומר הרדמה עשויים להיות תלויים במין הנוחקר. לדוגמה, עצב הריח של דג הזהב(Carassius auratus)קצר; במקרה זה, הקלטת EEG מנורת הריח יהיה קל יותר. הבחירה של ריחן עשוי גם תלוי, במידה מסוימת, על המין. המחקר הנוכחי השתמש בחומצות אמינו. ככל המחברים מודעים, כל מיני דגים נחקרו עד כה יש רגישות חוש הריח חומצות אמינו1,,18. רגישות זו הייתה מעורבת תהליכים מגוונים כגון מיקום מזון, תקשורת כימית והכרה של מיהלידה 19,,20,,21,,22,,23. עם זאת, הרגישויות של מינים שונים הן, באופן כללי, די דומות ולא תלויות באורח חיים או בבית גידול. הם גם מולקולות מוגדרות היטב והם זמינים בזול ובקלות. סיבות אלה הופכות אותם אידיאליים מבחן גירויים עבור מחקרים על olfaction בדגים, במיוחד אלה החוקרים את ההשפעות של הפרעות אנתרופוגנית (למשל, חומציות או זיהום), שבו ניתן להשוות בקלות את התוצאות על פנימינים 24.

בהתאם למין המדובר, ההכנות להקלטה מרובת יחידות יכולות להישאר יציבות למשך מספר שעות; משרעת התגובה לתקן הפנימי(10-3 M L-serine במחקר הנוכחי) לא צריכה להשתנות ביותר מ-10% בין בדיקות רצופות. כל סטייה משמעותית מכלל אצבע זה יכולה להיווות: (1) תנועה של הדג, ולכן עקירה של האלקטרודות ו/או צינור האף; (2) זיהום המים, למשל, על ידי יצירת קשר עם ידיו של הנסוי (במיוחד אם ריכוזים נמוכים יותר של ריח נתון נותנים תגובות גדולות יותר מאשר ריכוזים גבוהים יותר); או (3) הידרדרות בבריאות ההכנה). במקרה (i), יש לבדוק את הדגים על כך שעברו דירה; אם כן, למקם אותו מחדש, ולהוסיף הרדמה יותר למים ו / או לתת מנה נוספת של triethiodide גלמין. אפשר 5 דקות ובדוק שוב את הסטנדרט. אם התגובה עדיין קטנה יותר, למקם מחדש את האלקטרודות ו/או צינור האף עד שתירשם תגובה גדולה מספיק. במקרה (ii), פשוט ליצור מחדש סדרת דילול טרי של ריח, באמצעות כלי זכוכית נקיים ומים. במקרה (ג),יש לבדוק כי זרימת המים מעל הזימים של הדגים מספיקה, כי המים זורמים מעל הזימים (כלומר, יציאה דרך האופרקולה, ולא הפה), והמים הם aerated היטב. מינים שונים של דגים יש העדפות טמפרטורה שונות באופן נרחב; להבטיח כי הטמפרטורה במעבדה (ובקשר עם המים במגע עם הדג) קרובה ככל האפשר לטמפרטורה בה נשמרים הדגים. ודאו גם שהדגים אינם לחוצים, והימנעו מהעברתם (אפילו מטנק אחד למכל) לפחות שבוע לפני ההקלטה. רעש חשמלי הוא, כמובן, ההתלהמה של חייו של אלקטרופיזיולוג; עם זאת, המאמר הנוכחי אינו המדיום המתאים כדי לדון כיצד להתגבר / להפחית את זה. אף על פי כן, ‘מדריך Axon’ (זמין בחופשיות כקובץ PDF להורדה מאתר האינטרנט של היצרן) הוא מקור של ייעוץ מעשי על מזעור רעש. ברגע שתגובה גדולה ויציבה מתעוררת על ידי הגירוי הסטנדרטי, וסדרת ריכוז נותנת עלייה תלויה ריכוז במשרעת, עם תגובה מינימלית ריק, הקלטה תגובות לגירויים מבחן יכול להתחיל. חלק מהמחברים נותנים את אותו גירוי שלוש פעמים, ומחשבים את ממוצע החשבון לניתוח נתונים עוקב. עם זאת, אלה הם שכפולים טכניים, וגישה זו תגדיל את הזמן שהפעלה של הקלטה אורכת פי שלושה. המחברים הנוכחיים מעדיפים לבדוק פעם אחת ריח נתון, אבל תמיד חלק עקומת תגובת הריכוז. זה לא רק מאפשר את החישוב של סף הגילוי או EC50 (כמתואר), אלא גם מבטיח כי ריכוזים קרובים לאלה שהדגים יחוו בסביבה הטבעית שלו נבדקים (זה לא תמיד ידוע). יתר על כן, כל תגובות חריגות, בשל זיהום למשל, קל יותר לזהות; לאחר מכן ניתן לחזור על אלה באמצעות מדגם טרי במידת הצורך.

הקלטה מרובת יחידות מעצב הריח עשויה להיות פולשנית, אך היא רגישה יותר מה-EOG כאשר היא מוקלטת במיים 7, מכיוון שהיא אינה תלויה במלויתות חיצונית. לכן ניתן להשתמש בו כדי להעריך את רגישות חוש הריח לאודורנטים, כגון סידן ונתרן, שינויים בריכוזים אשר ישפיעו גם על מוליכות וכתוצאה מכך מתחיםשנרשמו 15. כהערכה של מספר ORNs להגיב ריח נתון (כלומר, פוטנציאל פעולה נסיעה לאורך אקסונים ORN מן האפיתל חוש הריח לנורה), הוא מייצג אות גלם, לא מעובד (עיבוד ראשוני של קלט ריח מתחיל בנורות). לכן, זהו פרמטר טוב יותר כדי להעריך את ההשפעות הישירות של מזהמים, כגון מתכות כבדות, ושינויים סביבתיים, כגון pH, על מערכת הריח מאשר EOG או EEG24,25. הקלטה מנורת הריח במי ים עם PCO2 גבוה (ולכן pH נמוך) עשוי להיות מושפע על ידי ההשפעות המרכזיות של pH על עיבוד עצבי; “גאבאקולטן התיאוריה” שלחומציות האוקיינוס 26, לפיה הפחתה pH מים גורמת הפצה מחדש של CL– ו HCO3– יון ב CSF וכתוצאה מכך שינוי של הפעלה GABAergic ממעכב (hyperpolarizing) כדי לעורר (depolarizing). יתר על כן, במחקרים כאלה, חשוב להעריך את ההשפעות של חומציות או מזהמים באמצעות ריכוזי ריח דומה לאלה הדגים עשוי להיתקל בסביבתו הטבעית. עבור חומצות אמינו, זה בננו לטווח micromolar27,,28,29; קרוב לסף הגילוי של תרכובות אלה בדגים1,,18. הערכת סף הגילוי עבור ריח נתון יכולה לתת מושג כלשהו על החשיבות ו/או התפקיד הביולוגי של רגישות הריח. לדוגמה, למפרי הים (Petromyzon marinus) יש רגישות גבוהה לרגישות חוש הריח לחומצות מרה ספציפיות ששוחררו על ידי זחלים עד לסף של 10-13 M30; רגישות זו מאפשרת למבוגרים לאתר ולזהות שטחי השרצה מתאימים, ולכן לפעול כפירומון נודד למרחקים ארוכים. באופן דומה, למפרי ים נקבה בשלה יש רגישות חוש הריח גבוהה זרעון (סף 10-14 M), פוליאמין שוחרר במילט על ידי זכרים, אשר לאחר מכן מושך אותם לקיני של זכרים זרע31. דגים אחרים יש גם רגישות חושהריח פוליאמינים 32,33,34,35, אבל לא עם סף נמוך מספיק של זיהוי כדי לתמוך בתפקיד פרומונים דומה; במקום זאת, מוצעת הימנעות מדגים רקובים. אף על פי כן, עם רגישויות חוש הריח גבוה כזה, ניתן לדמיין כי ירידה קלה ברגישות (כלומר, עלייה בסף), גם כאשר משרעת התגובה אינה מופחתת באופן דרמטי, עלול לגרום לבעיות חמורות עבורדגים 24.

כאשר התוויה חצי לוגריתמית, עקומות תגובת ריכוז לאודורנטים יכולות להיות אקספוננציאליות, ליניאריות או סיגמואידיות18. במקרה של חומצות אמינו, עקומות ריכוז-תגובה חצי לוגריתמיות כאלה הן ליניאריות (כלומר, לוגריתמי), סיגמואיד אופונקציות כוח 7. כי אין רוויה של התגובה נראה (כלומר, אין רמה בעקומות תגובת ריכוז, אפילו בריכוזים סופרה-סביבתיים) הוא כנראה בשל מספר קולטנים המחייבים חומצות אמינו בודדות, בהתאם לריכוז שלהם, ולא כל חומצת אמינו מחייב קולטן ספציפי; ככל שהריכוז של חומצת אמינו נתונה עולה, קולטנים יותר מסוגלים לקשור אותו ולכן להגיב. אף על פי כן, דגים יכולים להבחין ביןתערובותשל חומצותאמינו 36,37,38,39; זאת, ככל הנראה בשל דפוסי פעילות קומבנטוריים המעוררים בנורותהריח 12,40; האקסונים של כל ORNs המביעים את אותו חלבון קולטן לסיים באותו glomeruli בנורותחוש הריח 41,42,וחומצת אמינו אחת יכולה להפעיל יותר מglomerulus אחד.

עם זאת, ריחנים ספציפיים מאוד, כגון פרומונים, עשויים לעורר סיגמואיד או מעין סיגמואיד ריכוז-תגובהעקומות 43,44. ההסקנה, אם כי לא נבדק אמפירית, היא כי תגובות חוש הריח האלה הן בשל קולטנים ספציפיים מאוד אשר לאגד את מולקולת הפרומון ועוד מעט אחר. לכן, מעל ריכוז נתון, כל הקולטנים תפוסים, ועליות נוספות לא יעוררו תגובות נוספות ב-ORNs אחרים. לכן, ניתן לחשב נתונים אלה להתווה של שלושה פרמטרים של Hill, ותגובה מקסימלית, EC50 ו-Hill co-efficient,ניתן לחשב 15,45,46. זה יכול לתת מידע רב ערך, כגון זיקה לכאורה ומספר קולטן לכאורה, כי עקומות תגובת ריכוז ליניארי או מעריכי לא יכול לתת.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

העבודה במעבדת המחברים נתמכת על ידי Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), פורטוגל, פרויקטים PTDC/BIA-BMA/30262/2017 ו- UID/Multi/04326/2019 ותכנית חוזה DL57/2016/CP1361/CT041 ל-ZV.

Materials

AC pre-amplifier Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) NL104 Neurolog pre-amplifier specifically designed for this type of recording.
Digidata Molecular Devices, LLC. (San Jose, CA, USA) 1440A Analogue-digital converter.
EMG Integrator Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) NL703 Leaky' electrical integrator to integrate raw activity of the nerve.
Faraday cage Made in-house To reduce electrical noise.
Filter Digitimer Ltd (Welwyn Garden City, UK) NL125/6 Filter module for electrophysiological recording.
Gallamine triethiodide Sigma-Aldrich (Portugal) G8134 Neuromuscular blocker
L-glutamine Sigma-Aldrich (Portugal) G3126 Amino acid used as odorant
L-leucine Sigma-Aldrich (Portugal) L80000 Amino acid used as odorant
L-serine Sigma-Aldrich (Portugal) S4500 Amino acid used as odorant
Metalic base-plate Any Provides base for micro-manipulators.
Micro-hematocrit tubes Any To position water supply to the olfactory epithelium
Micro-manipulators Narishige International Ltd (London, UK) M-152 Position electrodes
MS222 (ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate salt) Sigma-Aldrich (Portugal) E10505 Anesthetic
pH probe Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) HI12302 Probe to measure pH of water.
Refractometer Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) HI96822 Refractometer to measure water salinity
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Portugal) 746398 For saline solution
Solenoid valves The Lee Co. (Essex, CT, USA) LFAA1201618H For switching between background water and stimuus solutions (no longer available)
Stereo-microscope Zeiss, Leica, Olympus Any suitable model. For dissection and placement of electrodes.
Titrator Hanna instruments (Póvoa de Varzim, Portugal) HI84531 Titrator to measure water alkalinity, pH and temperature.
Tungsten micro-electrodes 0.1 MΩ World Precision Instruments (Hitchin, UK) TM31A10 Extracellular electrodes.
Valve Driver Made in-house 12 V DC source for operating solenoid valves.
Water pump (submersible) Any To supply anesthetic-containing water to the gills of the fish.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kasumyan, A. O. The olfactory system in fish: structure, function, and role in behaviour. Journal of Ichthyology. 44 (Suppl 2), S180-S223 (2004).
  2. Michel, W. C., Evans, D. H., Claiborne, J. B. Chemoreception. The Physiology of Fishes. , 471-497 (2006).
  3. Wisenden, B. D., Sorensen, P. W., Wisenden, B. D. Chemical cues that indicate risk of predation. Fish Pheromones and Related Cues. , 131-148 (2015).
  4. Tierney, K. B., et al. Olfactory toxicity in fishes. Aquatic Toxicology. 96 (1), 2-26 (2010).
  5. Caprio, J., Spielman, A. I., Brand, J. G. In vivo olfactory and taste recordings in fish. Experimental Cell Biology of Taste and Olfaction. Current Techniques and Protocols. , 251-261 (1995).
  6. Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. The electoolfactogram: a review of its history and uses. Microscopy Research and Technique. 58, 152-160 (2002).
  7. Hubbard, P. C., Barata, E. N., Ozório, R. O. A., Valente, L. M. P., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to amino acids in the blackspot seabream (Pagellus bogaraveo): a comparison between olfactory receptor recording techniques in seawater. Journal of Comparative Physiology A. 197 (8), 839-849 (2011).
  8. Hamdani, E. H., Døving, K. B. The functional organization of the fish olfactory system. Progress in Neurobiology. 82 (2), 80-86 (2007).
  9. Hara, T. J., Zhang, C. Topographic bulbar projections and dual neural pathways of the primary olfactory neurons in salmonid fishes. Neuroscience. 82 (1), 301-313 (1998).
  10. Thommesen, G. The spatial distribution of odour induced potentials in the olfactory bulb of the char and trout (Salmonidae). Acta Physiologica Scandinavica. 102, 205-217 (1978).
  11. Nikonov, A. A., Caprio, J. Electrophysiological evidence for a chemotopy of biologically relevant odors in the olfactory bulb of the channel catfish. Journal of Neurophysiology. 86 (4), 1869-1876 (2001).
  12. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Chemotopic, combinatorial, and noncombinatorial odorant representations in the olfactory bulb revealed using a voltage-sensitive axon tracer. Journal of Neuroscience. 18 (23), 9977-9988 (1998).
  13. Pierrot, D. E., Lewis, E., Wallace, D. W. R. MS Excel programme developed for CO2 system calculations. ORNL/CDIAC-105a, Carbon Dioxide Information Analysis Center. , (2006).
  14. Hubbard, P. C., Barata, E. N., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to catecholamines and their metabolites in the goldfish. Chemical Senses. 28 (3), 207-218 (2003).
  15. Hubbard, P. C., Barata, E. N., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to changes in environmental [Ca2+] in the marine teleost Sparus aurata. Journal of Experimental Biology. 203 (24), 3821-3829 (2000).
  16. Hubbard, P. C., Ingleton, P. M., Bendell, L. A., Barata, E. N., Canário, A. V. M. Olfactory sensitivity to changes in environmental [Ca2+] in the freshwater teleost Carassius auratus: an olfactory role for the Ca2+-sensing receptor?. Journal of Experimental Biology. 205, 2755-2764 (2002).
  17. Byrd, R. P., Caprio, J. Comparison of olfactory receptor (EOG) and bulbar (EEG) responses to amino acids in the catfish, Ictalurus punctatus. Brain Research. 249 (1), 73-80 (1982).
  18. Hara, T. J. The diversity of chemical stimulation in fish olfaction and gustation. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 4 (1), 1-35 (1994).
  19. Kawabata, K. Induction of sexual behavior in male fish (Rhodeus ocellatus ocellatus) by amino acids. Amino Acids. 5 (3), 323-327 (1993).
  20. Shoji, T., Yamamoto, Y., Nishikawa, D., Kurihara, K., Ueda, H. Amino acids in stream water are essential for salmon homing migration. Fish Physiology and Biochemistry. 28 (1-4), 249-251 (2003).
  21. Yamamoto, Y., Hino, H., Ueda, H. Olfactory imprinting of amino acids in lacustrine sockeye salmon. PLoS ONE. 5 (1), e8633 (2010).
  22. Kutsyna, O., Velez, Z., Canário, A. V. M., Keller-Costa, T., Hubbard, P. C., Schulte, B., Goodwin, T., Ferkin, M. Variation in urinary amino acids in the Mozambique tilapia: a signal of dominance or individuality?. Chemical Signals in Vertebrates 13. , 189-204 (2016).
  23. Velez, Z., Hubbard, P. C., Hardege, J. D., Barata, E. N., Canário, A. V. M. The contribution of amino acids to the odour of a prey species in the Senegalese sole (Solea senegalensis). Aquaculture. 265, 336-342 (2007).
  24. Porteus, C. S., et al. Near-future CO2 levels impair the olfactory system of a marine fish. Nature Climate Change. 8 (8), 737-743 (2018).
  25. Velez, Z., Roggatz, C. C., Benoit, D. M., Hardege, J. D., Hubbard, P. C. Short- and medium-term exposure to ocean acidification reduces olfactory sensitivity in gilthead seabream. Frontiers in Physiology. 10, 731 (2019).
  26. Nilsson, G. E., et al. Near-future carbon dioxide levels alter fish behaviour by interfering with neurotransmitter function. Nature Climate Change. 2 (3), 201-204 (2012).
  27. Fuhrman, J. A., Ferguson, R. L. Nanomolar concentrations and rapid turnover of dissolved free amino acids in seawater: agreement between chemical and microbiological measurements. Marine Ecology – Progress Series. 33 (3), 237-242 (1986).
  28. Pomeroy, L. R., Macko, S. A., Ostrom, P. H., Dunphy, J. The microbial food web in Arctic seawater: concentration of dissolved free amino acids and bacterial abaundance and activity in the Arctic Ocean and in Resolute Passage. Marine Ecology – Progress Series. 61 (1-2), 31-40 (1990).
  29. Poulet, S. A., Williams, R., Conway, D. V. P., Videau, C. Co-occurrence of copepods and dissolved free amino acids in shelf sea waters. Marine Biology. 108 (3), 373-385 (1991).
  30. Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
  31. Scott, A. M., et al. Spermine in semen of male sea lamprey acts as a sex pheromone. PLoS Biology. 17 (7), e3000332 (2019).
  32. Da Silva, J. P., et al. Synthetic versus natural receptors: supramolecular control of chemical sensing in fish. ACS Chemical Biology. 9 (7), 1432-1436 (2014).
  33. Hussain, A., et al. High-affinity olfactory receptor for the death-associated odor cadaverine. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (48), 19579-19584 (2013).
  34. Michel, W. C., Sanderson, M. J., Olson, J. K., Lipschitz, D. L. Evidence of a novel transduction pathway mediating detection of polyamines by the zebrafish olfactory system. Journal of Experimental Biology. 206 (10), 1697-1706 (2003).
  35. Rolen, S. H., Sorensen, P. W., Mattson, D., Caprio, J. Polyamines as olfactory stimuli in the goldfish Carassius auratus. Journal of Experimental Biology. 206 (10), 1683-1696 (2003).
  36. Kang, J., Caprio, J. Electro-olfactogram and multiunit olfactory receptor responses to complex mixtures of amino acids in the channel catfish, Ictalurus punctatus. Journal of General Physiology. 98 (4), 699-721 (1991).
  37. Kang, J., Caprio, J. Electrophysiological responses of single olfactory bulb neurons to binary mixtures of amino acids in the channel catfish, Ictalurus punctatus. Journal of Neurophysiology. 74 (4), 1435-1443 (1995).
  38. Valentincic, T., Kralj, J., Stenovec, M., Koce, A., Caprio, J. The behavioral detection of binary mixtures of amino acids and their individual components by catfish. Journal of Experimental Biology. 203, 3307-3317 (2000).
  39. Valentincic, T., Wegert, S., Caprio, J. Learned olfactory discrimination versus innate taste responses to amino acids in channel catfish (Ictalurus punctatus). Physiology and Behavior. 55 (5), 865-873 (1994).
  40. Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
  41. Vassar, R., et al. Topographic organization of sensory projections to the olfactory bulb. Cell. 79 (6), 981-991 (1994).
  42. Mombaerts, P., et al. Visualizing an olfactory sensory map. Cell. 87 (4), 675-686 (1996).
  43. Keller-Costa, T., et al. Identity of a tilapia pheromone released by dominant males that primes females for reproduction. Current Biology. 24 (18), 2130-2135 (2014).
  44. Sorensen, P. W., Hara, T. J., Stacey, N. E. Extreme olfactory sensitivity of mature and gonadally-regressed goldfish to a potent steroidal pheromone, 17a,20b-dihydroxy-4-pregnen-3-one. Journal of Comparative Physiology A. 160 (3), 305-313 (1987).
  45. Keller-Costa, T., Canário, A. V. M., Hubbard, P. C. Olfactory sensitivity to steroid glucuronates in Mozambique tilapia suggests two distinct and specific receptors for pheromone detection. Journal of Experimental Biology. 217 (23), 4203-4212 (2014).
  46. Hubbard, P. C., Mota, V., Keller-Costa, T., da Silva, J. P., Canário, A. V. M. Chemical communication in tilapia: a comparison of Oreochromis mossambicus with O. niloticus. General and Comparative Endocrinology. 207, 13-20 (2014).

Tags

ExtracellularMulti-unit RecordingOlfactory NerveTeleostsOlfactory SensitivityMarine FishSensory SignalCNSControl WaterCarbon Dioxide WaterAnesthetized FishOlfactory NervesSea BreamSkull

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hubbard, P., Velez, Z. Extracellular Multi-Unit Recording from the Olfactory Nerve of Teleosts. J. Vis. Exp. (164), e60962, doi:10.3791/60962 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image