Drosophila Larval ve Pupal Testislerinin Canlı, Sağlam Dokuda Hücre Bölünmesi Analizi İçin Hazırlanması
Summary
Bu protokolün amacı, Drosophila meyozetik spermatositler kullanarak canlı ve sabit hücre mikroskobu ile bozulmamış dokudaki hücre bölünmesini analiz etmektir. Protokol, Drosophila larvaları ve erken pupalardan bütün, bozulmamış testislerin nasıl izole edilip, mikroskopi için nasıl işleyip monte edilebildiğini gösteriyor.
Abstract
Hücre bölünmesinin canlı, bozulmamış doku ve organlarda bölünmesi, hücre bölünmesinin gelişim, doku homeostazları ve hastalık süreçleri ile nasıl bütünleşiştüğünün anlaşılması için deneysel analizler gereklidir. (1) spermatosit içeren tüm Drosophila testisleri nispeten mikroskopi için hazırlamak kolay, çünkü meyozis geçiren Drosophila spermatositler bu analiz için idealdir, (2) spermatositlerin büyük boyutu onları iyi yüksek çözünürlüklü görüntüleme için uygun hale getirir, ve (3) güçlü Drosophila genetik araçları in vivo analizi ile entegre edilebilir. Burada, Drosophila üçüncü instar larvaları ve erken pupa tüm testislerin hazırlanması için kolayca erişilebilir bir protokol sıyoruz. Hazırlanan tüm testislerde meyotik spermatositlerin nasıl tanımlanabileceğimizi ve zaman atlamalı mikroskopi ile nasıl görüntülenebileceğimizi anlatıyoruz. Fiksasyon ve immünboyama tüm testisler için protokoller de sağlanmaktadır. Larva testislerinin kullanımı, spermatosit analizi nde yetişkin testislerini kullanan mevcut protokollere göre çeşitli avantajlara sahiptir. En önemlisi, larva testisleri erişkin testislere göre hücrelerle daha küçük ve daha az kalabalıktır ve bu spermatositlerin yüksek çözünürlüklü görüntülemesini büyük ölçüde kolaylaştırır. Bu avantajları ve protokollerin uygulamalarını göstermek için, zaman atlamalı konfokal mikroskopi ile görüntülenmiş tek bir spermatositte hücre bölünmesi sırasında iğ mikrotübüllerine göre endoplazmik retikulumun yeniden dağılımını gösteren sonuçlar sayılmaktadır. Protokoller floresan etiketli proteinler veya organel belirteçleri herhangi bir sayı ifadesi ile kombine edilebilir, yanı sıra gen mutasyonları ve diğer genetik araçlar, bu yaklaşım özellikle tüm doku ve organların fizyolojik bağlamında hücre bölünmesi mekanizmalarının analizi için güçlü hale.
Introduction
Hücre bölünmesi genellikle kültür1yetiştirilen hücre hatları kullanılarak incelenir. Biz bu çalışmalardan temel mekanizmaların paha biçilmez bir anlayış ve anlayış zenginliği kazanmış olsa da2, kültürde yetiştirilen hücreler tam olarak bozulmamış, canlı doku oluşur gibi hücre bölünmesi fizyolojisi özetlemek olamaz. Örneğin, bozulmamış doku ve organlarda, hücreler doğru yerde ve doğru zamanda bölmek gerekir, böylece döl hücreleri düzgün doku içinde yer, böylece uygun farklılaşma veya fonksiyonel programlar geçirebilir, ve böylece hücre çoğalması düzgün doku büyüme veya homeostaz ile koordine edilir3. Öte yandan kültürde yetişen hücreler için hücre bölünmesi genellikle kültür ortamı4’tekibüyüme faktörleri tarafından düzenlenir ve bu nedenle doku mimarisi veya gelişimsel sinyalizasyon gibi canlı çevresel faktörlerin bölünme sürecini nasıl etkilediğini bu hücrelerden öğrenemeyiz. HeLa ve U2OS hücreleri gibi hücre bölünmesini incelemek için kullanılan hücre hatlarının birçoğunun metastatik tümörlerden elde edildiğini belirtmek de önemlidir5. Bu nedenle, bu kanser hücrelerinin temel fizyolojisi birçok yönü, hücre döngüsü düzenleyici mekanizmalar ve kromozomal stabilite gibi, büyük olasılıkla sağlıklı hücrelere göre değiştirilmiştir. Hücre bölünmesi fizyolojisinin tam olarak anlaşılması, bu nedenle, fizyolojik düzenleyici mekanizmaları ve doku mimarisini koruyan, yerli, in vivo ortamlarda bölen hücreleri inceleme yeteneğimize bağlıdır.
Hücre bölünmesinin bozulmamış doku ve organlar da nasıl işlediğini anlamadaki gelişmeler, in vivo veya ex vivo analizine doğal zorluklar nedeniyle engellenir. İlk olarak, büyük organlar veya kalın dokular içinde mikroskobik analiz için bölen hücrelere erişmek zor veya imkansız olabilir. İkinci olarak, genellikle tek tek hücrelerin in vivo bölmek ne zaman tahmin etmek zordur. Üçüncü olarak, doku fizyolojisi hızla ex vivo kültür sırasında bozulabilir. Bu protokolde, Drosophila melanogaster spermatositlerin tam bozulmamış testisler içinde meyotik hücre bölünmeleri geçirerek canlı ve sabit analizi için kolayca erişilebilir yöntemleri açıklıyoruz. Bu hücreler canlı, ex vivo analiz için idealdir çünkü konfokal mikroskopi gibi standart optik yöntemlerle kolayca erişilebilirler, öngörülebilir zamanlarda ve konumlarda bölünürler ve bozulmamış testisler ex vivo kültüründe yaklaşık 24 saate kadar muhafaza edilebilir. Buna ek olarak, Drosophila spermatositler büyük yuvarlak hücrelerdir (yaklaşık 20-30 μm çapında) bölündüklerinde şekil değiştirmeyen, onları yüksek çözünürlükte, mil aparatı ve sitoplazmik organeller gibi hücresel bileşenlerin hızlandırılmış görüntülemesi için ideal hale getirir. Bu hücreler mitoz yerine meyozis geçmesine rağmen, temel hücre bölünmesi süreçlerinin çoğu bu iki hücre bölünmesi mekanizmaları arasında çok benzer6. Bu avantajlar, güçlü Drosophila genetik araçları ile birlikte, Drosophila spermatositler mil oluşumu ve düzenleme, sitokinenzis ve organel remodeling ve bölümleme7dahil olmak üzere temel hücre bölünmesi süreçlerinin ex vivo analizi için yaygın olarak kullanılan bir model yaptık7 ,8,9,10,11.
Spermatositler spermatogenezin meyotik evresinde olan hücrelerdir. Drosophilayılında, spermatogenez testis bir kutup küçük bir bölgede veya “hub” bulunan germline kök hücrelerin bir grup ile başlar12,13. Bu hücreler asimetrik bir mitoz bölünme, tek bir farklılaştırılmış spermatogonium yol açan. Spermatogonia sonra tek bir kist içinde yakından ilişkili kalır 16 hücrebir grup üretmek için dört senkron mitoz geçmesi. Bu aşamada hücreler mitotikten meyotik hücre döngüsüne geçiş tevesyetik olarak adlandırılırlar. Spermatositler hücre döngüsünün genişletilmiş bir G2 aşamasında yaklaşık iki ila üç gün geçirmek, sırasında onlar dramatik büyümek ve iki meiyotik bölünmeler ve sonraki spermiyogenez için hazırlık sitolojik değişikliklere uğrar13,14. Tek bir kist içinde 16 spermatosit tüm grup daha sonra aynı anda ilk meyotik bölünme girin. Böylece, birkaç meyotik spermatosit hücre bölünmesi ile devam ederken aynı anda görüntülenebilir. İlk meyotik bölünme yaklaşık 1,5 saat devam eder ve hemen ikinci meyotik bölünme tarafından takip edilir, olgun spermatozoa içine ayırt etmek için devam 64 toplam spermatidler verim.
Canlı hücre bölünmesi ni incelemek için spermatosit kullanmanın eşsiz bir avantajı, bozulmamış doku grupları nın veya hücrelerin kistlerinin spermatogenezin farklı aşamalarında sürekli ilerlemeleri dir ve spermatogenezin tüm aşamalarındaki hücreler genellikle herhangi bir testiste tanımlanabilir (Bkz. Şekil 3A). Bu nedenle, tüm testislerde meyotik hücreleri bulmak nispeten kolaydır. Bu hücreler yüksek çözünürlüklü görüntülemeye çok daha büyük ve daha elverişli olduğu için genellikle analizlerimizi ikinci meyozisyerine ilkine odaklarız, ancak her iki meyyotik bölümü de kapsayan tüm süreç başarılı bir şekilde görüntülenebilir. Ayrıca testis hazırlık ve kültür için genel protokol spermatogenez diğer süreçleri analiz etmek için de kullanılabilir unutulmamalıdır, önceki mitotik kök hücre veya spermatogonial bölünmeler veya spermatidler spermatozoa içine olgun olarak meydana gelen sitolojik değişiklikler gibi15. Spermatogenezbu yönlerinin çoğu drosophila ve insanlar arasında son derece korunur16.
Drosophila spermatositler Drosophila gelişiminin üçüncü instar larva evresi sırasında spermatogenezin meziyotik fazulaşmaya başlar13. Bu nedenle, üçüncü instar larvaları ile başlayan ve pupa ve yetişkinler de dahil olmak üzere yaşam döngüsü aşamalarından izole testisler spermatositlerin bölünmesi analizi için kullanılabilir. Spermatogenez17,18,,19canlı ve sabit analiz için yetişkin erkek sinekler testislerinin çıkarılması için çeşitli mükemmel protokoller mevcuttur. Bu protokoller spermatogenezin geç evrelerinin incelenmesi veya sadece yetişkinlerde görülebilen genetik belirteçlerin kullanılması gerekiyorsa tercih edilebilir. Protokol bunun yerine larvave erken pupadan testis hazırlığına odaklanır, çünkü bu aşamalarda testislerin özellikle yüksek çözünürlüklü, hızlandırılmış mikroskopi ile hücre bölünmesi analizine uygun çeşitli avantajları vardır. İlk olarak, larva ve pupa testisleri yetişkinlerden daha küçüktür ve organ içindeki hücreler daha az kalabalıktır. Bu nedenle, spermatositlerin bölünmesi genellikle larva testislerinin dış yüzeyine yakın, ışık saçılma dokusunun birden fazla katmanından nüfuz etmek zorunda kalmadan görüntülenebilir. İkinci olarak, erişkin testisler bağlı aksesuar organların kasılmaları nedeniyle ritmik hareket, ve bu hareketler bireysel hücrelerin zaman atlamalı görüntüleme zor olun. Ve üçüncüsü, larva testisleri pupal veya erişkin öldürücüye neden olan gen mutasyonlarını incelerken avantajlıdır. Yöntemlerimiz mikroskop aşamasında testislerin uzun vadeli kültür için optimize edilmiştir, hücre bölünmesi birden fazla tur görüntüleme veya aynı hazırlık spermatogenez birden fazla aşamada bireysel hücrelerin ilerlemesi için izin. Ayrıca tüm testislerin fiksasyonu ve immünboyması için bir protokol uyguluyoruz. Genel olarak, protokollerimiz özellikle bozulmamış dokuda hücre bölünmesi eğitimi almak isteyenler için yararlıdır ve spermatosit analizini yüksek derecede çekici Drosophila genetik araçlarıyla birleştirme yeteneği bu özellikle güçlü bir yaklaşım dır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spermatosit hücre bölünmesinin uzun süreli canlı görüntülemesi için optimize edilmiş larva veya erken pupal Drosophila testislerinin hazırlanması için bir protokol tanımladık. Bu bozulmamış doku fizyolojik bağlamında hücre bölünmesi analizi için güçlü bir yöntemdir. Bu yöntemin gücü, spesifik gen mutasyonları, dokuya özgü RNAi aracılı baskılama ve floresan olarak etiketlenmiş protein ve organel belirteçleri gibi Drosophila genetik araçlarıyla birleştirildiğinde …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Savunma Bakanlığı’nın J.T.S.’ye verdiği başlangıç fonları tarafından desteklendi.
Materials
| 5" Dissecting Probe | Fisher | 08-965-A | |
| 5.75" Glass Pasteur Pipet | Fisher | 13-678-20A | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Straight forcepts with fine tips |
| Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100 mL | |
| Lumox Dish 50 | Sarstedt | SAR946077410 | Gas-permeable tissue culture dish |
| Microscope Cover Glass | Fisher | 12-541-B | 22×22 mm, #1.5 glass coverslip |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-15 | Insect pins used to make scalpel tool |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade | Electron Microsocopy Sciences | 15714 | |
| Plan Beveled Edge Microscope Slides | Fisher | 12-549-5 | Slides used for dissections |
| PYREX Spot Plates | Fisher | 13-748B | 9-well glass dissecting dish |
| Schneider's Drosophila medium | Fisher | 21720-024 | |
| Syringe Filter, 0.22 µm | EMD Millipore | SLGS033SB | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | Microscopy mounting medium |
References
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38 (1), 2-16 (2006).
- Ong, J. Y., Torres, J. Z. Dissecting the mechanisms of cell division. The Journal of Biological Chemistry. 294 (30), 11382-11390 (2019).
- Levine, E. M. Cell cycling through development. Development. 131 (10), 2241-2246 (2004).
- Gross, S. M., Rotwein, P. Unraveling Growth Factor Signaling and Cell Cycle Progression in Individual Fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14628-14638 (2016).
- Mittelman, D., Wilson, J. H. The fractured genome of HeLa cells. Genome Biology. 14 (4), 111 (2013).
- Bury, L., Coelho, P. A., Glover, D. M. From Meiosis to Mitosis: The Astonishing Flexibility of Cell Division Mechanisms in Early Mammalian Development. Current Topics in Developmental Biology. 120, 125-171 (2016).
- Giansanti, M. G., Fuller, M. T. What Drosophila spermatocytes tell us about the mechanisms underlying cytokinesis. Cytoskeleton. 69 (11), 869-881 (2012).
- Karabasheva, D., Smyth, J. T. A novel, dynein-independent mechanism focuses the endoplasmic reticulum around spindle poles in dividing Drosophila spermatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 12456 (2019).
- Polevoy, G., et al. Dual roles for the Drosophila PI 4-kinase four wheel drive in localizing Rab11 during cytokinesis. Journal of Cell Biology. 187 (6), 847-858 (2009).
- Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biology. 2 (1), 8 (2004).
- Smyth, J. T., Schoborg, T. A., Bergman, Z. J., Riggs, B., Rusan, N. M. Proper symmetric and asymmetric endoplasmic reticulum partitioning requires astral microtubules. Open Biology. 5 (8), (2015).
- Demarco, R. S., Eikenes, &. #. 1. 9. 7. ;. H., Haglund, K., Jones, D. L. Investigating spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 218-227 (2014).
- Fuller, M. T., Bate, M., Martinez-Arias, A. . The Development of Drosophila melanogaster. , 71-147 (1993).
- Dunleavy, E. M., et al. The Cell Cycle Timing of Centromeric Chromatin Assembly in Drosophila Meiosis Is Distinct from Mitosis Yet Requires CAL1 and CENP-C. PLOS Biology. 10 (12), 1001460 (2012).
- Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2 (3), 197-212 (2012).
- Ramm, S. A., Scharer, L., Ehmcke, J., Wistuba, J. Sperm competition and the evolution of spermatogenesis. Molecular Human Reproduction. 20 (12), 1169-1179 (2014).
- Savoian, M. S. Microscopy Methods for Analysis of Spindle Dynamics in Meiotic Drosophila Spermatocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 265-276 (2017).
- Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological analysis of spermatogenesis: live and fixed preparations of Drosophila testes. Journal of Visualized Experiments. (83), e51058 (2014).
- Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
- Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. Journal of Cell Science. 125 (22), 5441-5452 (2012).
- Harel, A., et al. Persistence of major nuclear envelope antigens in an envelope-like structure during mitosis in Drosophila melanogaster embryos. Journal of Cell Science. 94 (3), 463-470 (1989).
- Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Mol Biol Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
- Tates, A. D. . Cytodifferentiation during spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An electron microscope study. , (1971).
- Gartner, S. M., Rathke, C., Renkawitz-Pohl, R., Awe, S. Ex vivo culture of Drosophila pupal testis and single male germ-line cysts: dissection, imaging, and pharmacological treatment. Journal of Visualized Experiments. (91), 51868 (2014).
- Ohkura, H. Meiosis: an overview of key differences from mitosis. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7 (5), (2015).
- Friedman, J. R., Webster, B. M., Mastronarde, D. N., Verhey, K. J., Voeltz, G. K. ER sliding dynamics and ER-mitochondrial contacts occur on acetylated microtubules. Journal of Cell Biology. 190 (3), 363-375 (2010).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1270-1272 (2011).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 102-104 (2012).
