Voorbereiding van Drosophila Larval en Pupal Testes voor analyse van celafdeling in levend, intact weefsel

Celdeling wordt vaak bestudeerd met behulp van cellijnen gekweekt in cultuur¹. Hoewel we een schat aan waardevol inzicht en begrip van fundamentele mechanismen uit deze studies hebben opgedaan^2,kunnen cellen die in cultuur worden gekweekt de fysiologie van celdeling niet volledig samenvatten omdat het voorkomt in intact, levend weefsel. In intacte weefsels en organen moeten cellen zich bijvoorbeeld op de juiste plaats en op het juiste moment verdelen, zodat nageslachtcellen zich goed in het weefsel bevinden, zodat ze passende differentiatie of functionele programma’s kunnen ondergaan, zodat celproliferatie goed wordt gecoördineerd met weefselgroei of homeostase³. Voor cellen die in cultuur worden gekweekt, wordt celdeling over het algemeen geregeld door groeifactoren in het kweekmedium⁴, en dus kunnen we niet van deze cellen leren hoe in vivo omgevingsfactoren zoals weefselarchitectuur of ontwikkelingssignalering het delingproces beïnvloeden. Het is ook belangrijk op te merken dat veel van de cellijnen die worden gebruikt om celdeling te bestuderen, zoals HeLa en U2OS-cellen, waren afgeleid van gemetastaseerde tumoren⁵. Daarom zijn veel aspecten van de basisfysiologie van deze kankercellen, zoals celcyclus regulerende mechanismen en chromosomale stabiliteit, waarschijnlijk veranderd in vergelijking met gezonde cellen. Volledig begrip van de fysiologie van de celdeling hangt daarom af van ons vermogen om delende cellen in hun eigen, in vivo omgevingen te bestuderen die fysiologische regulerende mechanismen en weefselarchitectuur behouden.

Vooruitgang bij het begrijpen van de werking van celdeling in intacte weefsels en organen wordt belemmerd door moeilijkheden die inherent zijn aan in vivo of ex vivo analyse. Ten eerste kan het moeilijk of onmogelijk zijn om toegang te krijgen tot delende cellen voor microscopische analyse in grote organen of dikke weefsels. Ten tweede is het vaak moeilijk te voorspellen wanneer individuele cellen zich in vivo zullen verdelen. Ten derde kan de weefselfysiologie snel verslechteren tijdens de ex vivo-cultuur. In dit protocol beschrijven we gemakkelijk toegankelijke methoden voor live en vaste analyse van Drosophila melanogaster spermatocyten omdat ze meiotische celdelingen ondergaan binnen volledig intacte teelballen. Deze cellen zijn ideaal voor live, ex vivo analyse omdat ze gemakkelijk toegankelijk zijn met standaard optische methoden zoals confocale microscopie, ze verdelen op voorspelbare tijden en locaties, en intacte teelballen kunnen worden gehandhaafd in ex vivo cultuur voor ongeveer 24 uur. Bovendien zijn Drosophila spermatocyten grote ronde cellen (ongeveer 20-30 μm in diameter) die niet van vorm veranderen wanneer ze zich verdelen, waardoor ze ideaal zijn voor hoge resolutie, time-lapse beeldvorming van cellulaire componenten zoals het spindelapparaat en cytoplasmale organellen. Hoewel deze cellen meiose ondergaan in tegenstelling tot mitose, zijn veel van de essentiële celdelingprocessen zeer vergelijkbaar tussen deze twee celdelingmechanismen⁶. Deze voordelen, gecombineerd met krachtige Drosophila genetische hulpmiddelen, hebben Drosophila spermatocyten een veelgebruikt model voor ex vivo analyse van essentiële celdelingprocessen met inbegrip van asvorming en regelgeving, cytokinese, en organelle het remodelleren en het verdelen^{7gemaakt,8,9,10,11}.

Spermatocyten zijn cellen die zich in het meinotische stadium van spermatogenese bevinden. In Drosophilabegint spermatogenese met een groep kiembaanstamcellen die zich in een klein gebied bevinden of “hub” op één pool van de testis^12,13. Deze cellen delen door een asymmetrische mitose, die aanleiding geeft tot een enkele gedifferentieerde spermatogonium. Spermatogonia ondergaan vervolgens vier synchrone mitosen om een groep van 16 cellen te produceren die nauw verbonden blijven binnen een enkele cyste. In dit stadium gaan de cellen over van een mitotische naar een menotische celcyclus en worden ze spermatocyten genoemd. Spermatocyten brengen ongeveer twee tot drie dagen door in een verlengde G2-fase van de celcyclus, waarin ze dramatisch groeien en cytologische veranderingen ondergaan in de voorbereiding op de twee meiotische divisies en de daaropvolgende^{zaadsperma13,14}. De hele groep van 16 spermatocyten binnen een enkele cyste gaat vervolgens tegelijkertijd de eerste meiotische divisie in. Zo kunnen verschillende meiotische spermatocyten tegelijkertijd worden afgebeeld terwijl ze door celdeling gaan. De eerste meiotische divisie gaat ongeveer 1,5 uur te werk en wordt vrijwel onmiddellijk gevolgd door de tweede menotische divisie, die in totaal 64 spermatids oplevert die zich gaan onderscheiden in volwassen spermatozoa.

Een uniek voordeel van het gebruik van spermatocyten om celdeling in levend, intact weefsel te bestuderen, is dat groepen of cysten van cellen voortdurend vooruitgang boeken in de verschillende stadia van spermatogenese, en cellen in alle stadia van spermatogenese kunnen meestal worden geïdentificeerd in een bepaalde testis (zie figuur 3A). Daarom is het relatief eenvoudig om meiotische cellen in hele teelballen te vinden. Over het algemeen richten we onze analyses op de eerste in plaats van op tweede meiose, omdat deze cellen veel groter en beter vatbaar zijn voor beeldvorming met hoge resolutie, maar het hele proces dat beide meiotic-divisies omvat, kan met succes worden weergegeven. Er moet ook worden opgemerkt dat het algemene protocol voor testisvoorbereiding en -cultuur ook kan worden gebruikt om andere processen van spermatogenese te analyseren, zoals de eerdere mitotische stamcel- of spermatogonale divisies of de cytologische veranderingen die optreden als spermatids rijpen in spermatozoa^15. Veel van deze aspecten van spermatogenese zijn zeer bewaard gebleven tussen Drosophila en mensen¹⁶.

Drosophila spermatocyten beginnen de meiotische fase van spermatogenese te bereiken tijdens het derde instar larve stadium van Drosophila ontwikkeling¹³. Daarom kunnen teelballen geïsoleerd vanaf levenscyclusstadia die beginnen met derde instarlarven en met inbegrip van poppen en volwassenen worden gebruikt voor de analyse van delende spermatocyten. Er zijn verschillende uitstekende protocollen beschikbaar voor de extractie van teelballen van volwassen mannelijke vliegen voor levende en vaste analyse van spermatogenese^17,18,19. Deze protocollen kunnen de voorkeur hebben voor het bestuderen van late stadia van spermatogenese of als genetische markers die alleen zichtbaar zijn bij volwassenen moeten worden gebruikt. Het protocol richt zich in plaats daarvan op testisvoorbereiding van larven en vroege poppen, omdat teelballen in deze stadia verschillende voordelen hebben die specifiek relevant zijn voor celdelinganalyse door hoge resolutie, time-lapse microscopie. Ten eerste zijn teelballen van larven en poppen kleiner dan die van volwassenen en zijn de cellen in het orgaan minder druk. Hierdoor kunnen delende spermatocyten vaak worden afgebeeld in de buurt van het buitenoppervlak van larve teelballen, zonder dat ze door meerdere lagen lichtverstrooiend weefsel hoeven te dringen. Ten tweede bewegen volwassen teelballen ritmisch als gevolg van samentrekkingen van de bijgevoegde accessoireorganen, en deze bewegingen maken time-lapse beeldvorming van individuele cellen uitdagend. En ten derde, larve teelballen zijn voordelig bij het bestuderen van genmutaties die pop of volwassen dodelijkheid veroorzaken. Onze methoden zijn geoptimaliseerd voor de lange termijn cultuur van teelballen op de microscoop fase, waardoor beeldvorming van meerdere rondes van celdeling of de progressie van individuele cellen door meerdere stadia van spermatogenese in hetzelfde preparaat. We beschrijven ook een protocol voor fixatie en immunostaining van hele teelballen. Over het algemeen zijn onze protocollen bijzonder nuttig voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van celdeling in intact weefsel, en de mogelijkheid om spermatocytenanalyse te combineren met zeer hardnekkige Drosophila genetische hulpmiddelen maakt dit een bijzonder krachtige aanpak.