Purificación de fibroblastos y células Schwann de los nervios sensoriales y motores en Vitro
Summary
Aquí, presentamos un método para purificar fibroblastos y células Schwann de nervios sensoriales y motores in vitro.
Abstract
Las principales células del sistema nervioso periférico son las células Schwann (SCs) y los fibroblastos. Ambas células expresan claramente los fenotipos sensoriales y motores implicados en diferentes patrones de expresión génica del factor neurotrófico y otros procesos biológicos, afectando la regeneración nerviosa. El presente estudio ha establecido un protocolo para obtener SCs y fibroblastos sensoriales y motores altamente purificados más rápidamente. La raíz ventral (nervio motor) y la raíz dorsal (nervio sensorial) de ratas neonatales (7 días de edad) se disociaron y las células se cultivaron durante 4-5 días, seguidos por el aislamiento de fibroblastos sensoriales y motores y CC mediante la combinación secuencial de digestión diferencial y adherencia diferencial. Los resultados de los análisis de inmunocitoquímica y citometría de flujo mostraron que la pureza de los CC y fibroblastos sensoriales y motores eran >90%. Este protocolo se puede utilizar para obtener un gran número de fibroblastos/SCs sensoriales y motores más rápidamente, contribuyendo a la exploración de la regeneración sensorial y nerviosa motora.
Introduction
En el sistema nervioso periférico, las fibras nerviosas consisten principalmente en axones, células Schwann (SCs) y fibroblastos, y también contiene un pequeño número de macrófagos, células endoteliales microvasculares, y células inmunitarias1. Los SCs envuelven los axones en una proporción de 1:1 y están encerrados por una capa de tejido conectivo llamada endoneurium. Los axones se agrupan para formar grupos llamados fascículos, y cada fascículo se envuelve en una capa de tejido conectivo conocida como perineurium. Finalmente, toda la fibra nerviosa se envuelve en una capa de tejido conectivo, que se denomina epineurio. En el endoneurium, toda la población celular se compone de 48% DE SCs, y una porción sustancial de las células restantes involucra fibroblastos2. Además, los fibroblastos son componentes importantes de todos los compartimentos nerviosos, incluyendo el epineurium, el perineurium y el endoneurium3. Muchos estudios han indicado que los SCs y los fibroblastos desempeñan un papel crucial en el proceso de regeneración después de las lesiones del nervio periférico4,,5,6. Después de la transección del nervio periférico, los fibroblastos perineuriales regulan la clasificación celular a través de la vía de señalización de ephrin-B/EphB2 entre SCs y fibroblastos, guiando aún más el recrecimiento axonal a través de las heridas5. Los fibroblastos nerviosos periféricos secretan la proteína tenascina-C y mejoran la migración de los SCs durante la regeneración nerviosa a través de la vía de señalización de 1-integrina7. Sin embargo, los SCs y fibroblastos utilizados en los estudios anteriores se derivaron del nervio ciático, que incluye los nervios sensoriales y motores.
En el sistema nervioso periférico, los nervios sensoriales (nervios aferentes) llevan a cabo la señalización sensorial desde los receptores al sistema nervioso central (SNC), mientras que los nervios motores (nervios eferentes) conducen señales desde el SNC hasta los músculos. Estudios previos han indicado que los SCs expresan fenotipos motores y sensoriales distintos y secretan factores neurotróficos para apoyar la regeneración de los nervios periféricos8,,9. Según un estudio reciente, los fibroblastos también expresan diferentes fenotipos motores y sensoriales y afectan la migración de SCs10. Así, la exploración de las diferencias entre los fibroblastos/SC motores y nerviosos sensoriales nos permite estudiar los complicados mecanismos moleculares subyacentes de la regeneración específica del nervio periférico.
En la actualidad, existen muchas formas de purificar los CC y los fibroblastos, incluida la aplicación de agentes antimitoticos, citolisis mediada por anticuerpos11,12, inmunopanning secuencial13 y sustrato de laminina14. Sin embargo, todos los métodos anteriores eliminan los fibroblastos y preservan sólo los SCs altamente purificados y los fibroblastos se pueden obtener mediante la tecnología de clasificación de citometría de flujo15,pero es una técnica lenta y costosa. Por lo tanto, en este estudio, se desarrolló un método simple de digestión diferencial y adherencia diferencial para purificar y aislar fibroblastos sensoriales y nerviosos y SCs con el fin de obtener un gran número de fibroblastos y SCs más rápidamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las dos principales poblaciones celulares de los nervios periféricos incluían CC y fibroblastos. Los fibroblastos y SCs cultivados principalmente pueden ayudar con precisión a modelar la fisiología de fibroblastos y CC durante el desarrollo y la regeneración de los nervios periféricos. El estudio mostró que las células nerviosas ciáticas de rata P7 contenían alrededor del 85% de S100-positivas SCs, 13% de fibroblastos OX7 positivos y sólo 1.5% de macrófagos OX42 positivos13. Aunque el …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (Grant No. 2017YFA0104703), la Fundación Natural Nacional de China (Grant No. 31500927).
Materials
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) – Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
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