Purificazione dei fibroblasti e delle cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in Vitro
Summary
Qui, presentiamo un metodo per purificare i fibroblasti e le cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in vitro.
Abstract
Le cellule principali del sistema nervoso periferico sono le cellule di Schwann (SC) e i fibroblasti. Entrambe queste cellule esprimono distintamente i fenotipi sensoriali e motori coinvolti in diversi modelli di espressione genica del fattore neurotrofico e altri processi biologici, che influenzano la rigenerazione dei nervi. Il presente studio ha stabilito un protocollo per ottenere più rapidamente SC e fibroblasti di ratti altamente purificati e motori. La radice ventrale (nervo motore) e la radice dorsale (nervo sensoriale) dei ratti neo-cicliali (7 giorni) sono state dissociate e le cellule sono state coltivate per 4-5 giorni, seguite dall’isolamento dei fibroblasti sensoriali e motori e delle SC combinando in sequenza metodi differenziali di digestione e aderenza differenziale. I risultati delle analisi di immunocitochimica e citometria di flusso hanno mostrato che la purezza delle SC e dei fibroblasti sensoriali e motori era >90%. Questo protocollo può essere utilizzato per ottenere un gran numero di fibroblasti/SC sensoriali e motori, contribuendo all’esplorazione della rigenerazione del nervo sensoriale e motorio.
Introduction
Nel sistema nervoso periferico, le fibre nervose sono costituite principalmente da assoni, cellule di Schwann (SC) e fibroblasti, e contiene anche un piccolo numero di macrofagi, cellule endoteliali microvascolari e cellule immunitarie1. Le SC avvolgono gli assoni in un rapporto 1:1 e sono racchiuse da uno strato di tessuto connettivo chiamato endoneurium. Gli assoni vengono poi raggruppati insieme per formare gruppi chiamati fascicle, e ogni fascicolo è avvolto in uno strato di tessuto connettivo noto come perineurium. Infine, l’intera fibra nervosa è avvolta in uno strato di tessuto connettivo, che è chiamato l’epineurium. Nell’endoneurium, l’intera popolazione cellulare è composta da 48% SC, e una parte sostanziale delle cellule rimanenti coinvolge fibroblasti2. Inoltre, i fibroblasti sono componenti importanti di tutti i compartimenti nervosi, tra cui l’epineurium, il perineurium e l’endoneurium3. Molti studi hanno indicato che SC e fibroblasti svolgono un ruolo cruciale nel processo di rigenerazione dopo le lesioni nervose periferiche4,5,6. Dopo la transezione del nervo periferico, i fibroblasti perineuriali regolano lo smistamento delle cellule attraverso il percorso di segnalazione ephrin-B/EphB2 tra SC e fibroblasti, guidando ulteriormente la ricrescita assonale attraverso le ferite5 . I fibroblasti nervosi periferici secernono la proteina tenascina-C e migliorano la migrazione delle SC durante la rigenerazione dei nervi attraverso il percorso di segnalazione dell’integrazione diz1 7. Tuttavia, le SC e i fibroblasti utilizzati negli studi di cui sopra sono stati derivati dal nervo sciatico, che include nervi sensoriali e motori.
Nel sistema nervoso periferico, i nervi sensoriali (nervi afferenti) conducono segnali sensoriali dai recettori al sistema nervoso centrale (SNC), mentre i nervi motori (nervi efferenti) conducono segnali dal SNC ai muscoli. Studi precedenti hanno indicato che le Ccs esprimono fenotipi motori e sensoriali distinti e secernono fattori neurotrofici per sostenere la rigenerazione del nervo periferico8,9. Secondo un recente studio, i fibroblasti esprimono anche diversi fenotipi motori e sensoriali e influenzano la migrazione delle SC10. Pertanto, l’esplorazione delle differenze tra fibroblasti nervosi motori e sensoriali/SC ci permette di studiare i complicati meccanismi molecolari sottostanti della rigenerazione specifica del nervo periferico.
Attualmente, ci sono molti modi per purificare Le SC e i fibroblasti, tra cui l’applicazione di agenti antimitotici, citolisi mediata da anticorpi11,12, immunopanning sequenziale13 e substrato di laminina14. Tuttavia, tutti i metodi di cui sopra rimuovono i fibroblasti e conservano solo le SCs. SCs altamente purificate e i fibroblasti possono essere ottenuti con la tecnologia di selezione della citometria di flusso15, ma è una tecnica che richiede tempo e denaro. Quindi, in questo studio, è stata sviluppata una semplice digestione differenziale e un metodo di aderenza differenziale per purificare e isolare i fibroblasti nervosi sensoriali e motori e le SC al fine di ottenere un gran numero di fibroblasti e SC più rapidamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le due principali popolazioni cellulari di nervi periferici includevano SC e fibroblasti. I fibroblasti e le SC coltivati principalmente possono aiutare con precisione a modellare la fisiologia di fibroblasti e SC durante lo sviluppo e la rigenerazione dei nervi periferici. Lo studio ha mostrato che le cellule nervose sciatiche di ratti P7 contenevano circa l’85% degli SC S100 positivi, il 13% dei fibroblasti positivi a OX7 e solo l’1,5% dei macrofagi oX42 positivi13. Anche se il numero di fibrobl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2017YFA0104703), dalla National Natural Foundation of China (Grant n. 31500927).
Materials
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) – Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
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