تنقية الخلايا الليفية وخلايا شوان من الأعصاب الحسية والحركية في المختبر
Summary
هنا، نقدم طريقة لتنقية الخلايا الليفية وخلايا شوان من الأعصاب الحسية والحركية في المختبر.
Abstract
الخلايا الرئيسية في الجهاز العصبي المحيطي هي خلايا Schwann (SCs) والخلايا الليفية. كل من هذه الخلايا تعبر بوضوح عن الأنماط الظاهرية الحسية والحركية المشاركة في أنماط مختلفة من التعبير الجيني عامل العصبية والعمليات البيولوجية الأخرى، مما يؤثر على تجديد الأعصاب. وقد وضعت هذه الدراسة بروتوكولا للحصول على درجة عالية من تنقية الفئران الحسية والمحركات SCs والالخلايا الليفية بسرعة أكبر. تم فصل الجذر البطني (العصب الحركي) والجذر الظهري (العصب الحسي) للفئران الوليدية (7 أيام من العمر) وتم استزراع الخلايا لمدة 4-5 أيام ، تليها عزل الخلايا الليفية الحسية والحركية وSCs من خلال الجمع بين الهضم التفاضلي وأساليب الالتزام التفاضلي بشكل تسلسلي. أظهرت نتائج التحليلات في الكيمياء المناعية والتدفق للخلايا أن نقاء الـ SCs الحسية والحركية والليفية كانت >90٪. يمكن استخدام هذا البروتوكول للحصول على عدد كبير من الخلايا الليفية الحسية والحركية /SCs بسرعة أكبر ، مما يساهم في استكشاف تجديد الأعصاب الحسية والحركية.
Introduction
في الجهاز العصبي المحيطي ، تتكون الألياف العصبية بشكل رئيسي من محاور عصبية وخلايا Schwann (SCs) ، والخلايا الليفية ، وتحتوي أيضًا على عدد قليل من الضامة والخلايا البطانية الدقيقة الوعائية والخلايا المناعية1. SCs التفاف محاور عصبية في نسبة 1:1 وترفق من قبل طبقة النسيج الضام يسمى endoneurium. ثم يتم تجميع المحاور معًا لتشكيل مجموعات تسمى كراسات، ويتم تغليف كل كراسة في طبقة نسيج الضامة المعروفة باسم perineurium. وأخيرا، يتم لف الألياف العصبية كلها في طبقة من النسيج الضام، والذي يطلق عليه الإبينوريوم. في endoneurium ، وتتألف من مجموع الخلايا كلها 48 ٪ SCs ، وجزء كبير من الخلايا المتبقية ينطوي على الخلايا الليفية2. وعلاوة على ذلك، الخلايا الليفية هي مكونات هامة لجميع مقصورات الأعصاب، بما في ذلك الإبينوريوم، والبيرينوريوم، و endoneurium3. وقد أشارت العديد من الدراسات إلى أن SCs والخلايا الليفية تلعب دورا حاسما في عملية التجديد بعد إصابات الأعصاب الطرفية4,5,6. بعد نقل العصب المحيطي، ينظم الخلايا الليفية المحيطة فرز الخلايا عبر مسار إشارة ephrin-B/EphB2 بين SCs واللوثريات الليفية، وتوجيه المزيد من إعادة نمو محور عصبي من خلال الجروح5. الخلايا الليفية العصبية الطرفية تفرز بروتين tenascin-C وتعزز هجرة SCs أثناء تجديد الأعصاب من خلال β1-integrin signals pathway7. ومع ذلك، استمدت SCs و الليفية المستخدمة في الدراسات المذكورة أعلاه من العصب الوركي، والذي يشمل كلا من الأعصاب الحسية والحركية.
في الجهاز العصبي المحيطي، تقوم الأعصاب الحسية (الأعصاب المُعَدّة) بإجراء إشارات حسية من المستقبلات إلى الجهاز العصبي المركزي (CNS)، بينما تقوم الأعصاب الحركية (الأعصاب المُفَرّضة) بإجراء إشارات من الجهاز المركزي للعضلات. وقد أشارت الدراسات السابقة إلى أن SCs التعبير عن أنواع ظاهرية الحركية والحسية متميزة وإفراز العوامل العصبية لدعم تجديد الأعصاب الطرفية8,9. وفقا لدراسة حديثة، الليفية أيضا التعبير عن مختلف الحركية والأنماط الظاهرية الحسية وتؤثر على هجرة SCs10. وهكذا، فإن استكشاف الاختلافات بين الخلايا الليفية العصبية الحركية والحسية/الخلايا العصبية العصبية يسمح لنا بدراسة الآليات الجزيئية الأساسية المعقدة للتجديد المحددة للأعصاب الطرفية.
في الوقت الحاضر، وهناك العديد من الطرق لتنقية SCs والخلايا الليفية، بما في ذلك تطبيق العوامل المضادة للmitotic، والخلايا التي تعمل بوساطة الأجسام المضادة11،12، مناعة متتابعة13 و لامينين substratum14. ومع ذلك، جميع الأساليب المذكورة أعلاه إزالة الخلايا الليفية والحفاظ على SCs فقط. SCs المنقى للغاية والليفية يمكن الحصول عليها عن طريق تدفق تكنولوجيا فرز الخلايا15، لكنه تقنية تستغرق وقتا طويلا ومكلفة. ومن ثم، في هذه الدراسة، تم تطوير عملية هضم التفاضلية البسيطة وطريقة الالتزام التفاضلي لتنقية وعزل الخلايا الليفية العصبية الحسية والحركية وSCs من أجل الحصول على عدد كبير من الخلايا الليفية والـ SCs بسرعة أكبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
وشملت المجموعتين الخلايا الرئيسية للأعصاب الطرفية SCs والخلايا الليفية. يمكن للخلايا الليفية المستزرعة في المقام الأول وSCs أن تساعد بدقة في نمّام فسيولوجيا الخلايا الليفية والـ SCs أثناء تطوير الأعصاب المحيطية وتجديدها. وأظهرت الدراسة أن الخلايا العصبية الوركية الفئران P7 تحتوي على حوالي 85…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذه الدراسة البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (منحة رقم 2017YFA0104703)، المؤسسة الوطنية الطبيعية في الصين (منحة رقم 31500927).
Materials
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) – Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
References
- Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
- Schubert, T., Friede, R. L. The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).
- Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior. European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).
- Lavdas, A. A., et al. Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143 (1), 145-155 (2010).
- Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration. Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).
- Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).
- Hoke, A., et al. Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration. Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).
- Brushart, T. M., et al. Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro. Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).
- He, Q., et al. Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts. Frontiers in Neuroscience. 12, 1016 (2018).
- Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Palomo Irigoyen, M., et al. Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells. Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).
- Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation. Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).
- Pannunzio, M. E., et al. A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).
- Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting. Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).
- He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells. Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).
- Weiss, T., et al. Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype. Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).
