Realizando biópsias de pinça guiadas colonoscópicas em camundongos e avaliando alterações subsequentes de tecido
Summary
Aqui, fornecemos uma descrição detalhada do procedimento para induzir biópsias de pinça guiadas colonoscópicas em camundongos e rastrear o fechamento de feridas em tempo real. Além disso, são fornecidos métodos para a preparação de tecidos para análises histológicas, imunohistoquímicas e moleculares do leito da ferida.
Abstract
Compreender as alterações teciduais e celulares que ocorrem na resposta de lesão aguda, bem como durante o processo de cicatrização da ferida, é de suma importância no estudo de doenças do trato gastrointestinal (GI). O modelo de biópsia de pinças coloniais murinas é uma ferramenta útil para definir esses processos. Além disso, a interação entre o conteúdo luminal intestinal (por exemplo, micróbios) e o cólon pode ser estudada. No entanto, a indução da ferida e a capacidade de rastrear o fechamento da ferida ao longo do tempo de forma confiável podem ser desafiadoras. Além disso, a preparação e orientação tecidual devem ser realizadas de forma padronizada para interrogar de forma ideal alterações histológicas e moleculares. Aqui, apresentamos um método detalhado descrevendo a lesão induzida pela biópsia e o monitoramento do fechamento da ferida através de colonoscopias repetidas. Uma abordagem é descrita que garante medições consistentes e reprodutíveis do tamanho da ferida, a capacidade de coletar o leito da ferida para análises moleculares, bem como visualizar o leito da ferida após a secção dos tecidos. A capacidade de realizar com sucesso essas técnicas permite estudos da resposta de lesão aguda, cicatrização de feridas e interações luminal-hospedeira dentro do cólon.
Introduction
O trato gastrointestinal (GI) é um sistema de órgãos complexo dadas suas múltiplas funções, tipos de células hospedeiras (por exemplo, epiteliais, imunes, estromicas, etc.) bem como trilhões de micróbios. Diante dessa complexidade, as doenças do trato de GI muitas vezes envolvem a interação de todos esses fatores. Por exemplo, as doenças inflamatórias intestinais (DII) estão associadas a ciclos de inflamação e remissão no trato GI, envolvendo a ativação de células inflamatórias, disbiose e reparação epitelial1,2,3,4,5,6,7. Ter sistemas de modelos adequados para estudar o DIB e outras condições inflamatórias do trato GI é fundamental para elucidar a patogênese da doença. Existem vários modelos para estudar a patogênese do IBD, incluindo camundongos geneticamente modificados e o uso de produtos químicos como o sulfato de sódio dextran (DSS) em roedores8,9,10. As limitações desses modelos incluem a incapacidade de controlar precisamente a indução da inflamação, bem como dificuldades na avaliação da cicatrização da ferida. Métodos alternativos para imitar aspectos da patogênese do IBD podem ser úteis para o desenvolvimento de terapias.
Biópsias de pinças orientadas colonoscópicas em camundongos oferecem um sistema modelo útil para estudar a patogênese da resposta inflamatória, a cicatrização de feridas, bem como interações hospedeira-micróbios no cólon. Esta abordagem foi usada pela primeira vez como ferramenta experimental em 2009, que demonstrou sua utilidade para estudar a resposta inflamatória aguda e a cicatrização de feridas no intestino11. Estudos subsequentes utilizaram essa técnica para avaliar os papéis de diferentes vias de sinalização, bem como a microbiota intestinal, na cicatrização de feridas coloniais11,12,13,14,15,16,17,18. Mais recentemente, nosso grupo usou esse modelo para investigar a importância da sinalização de sphingosine-1-fosfato e bactérias na resposta aguda à lesão cólon19. Embora útil, realizar biópsias de pinças guiadas colonoscópicas em camundongos e avaliar alterações de tecido subsequentes pode ser tecnicamente desafiador. Por exemplo, a perfuração do intestino pode ocorrer após a indução de lesão e garantir medidas consistentes do leito da ferida através de colonoscopias seriais pode ser difícil. Além disso, orientar adequadamente o tecido colonial para visualizar o leito da ferida para análises histológicas ou imunohistoquímicas pode ser um desafio. Embora existam algumas informações sobre esses métodos18,20, uma descrição precisa dessas técnicas junto promete melhorar a confiabilidade e a utilidade mais ampla deste modelo. Aqui, apresentamos um método detalhado para realizar biópsias de pinças colonoscópicas guiadas em camundongos, rastrear o fechamento de feridas ao longo do tempo e preparar o tecido para permitir análises histológicas e moleculares do leito da ferida. A criação de um método padrão para a realização dessas técnicas pode expandir o uso deste modelo para estudar mediadores não investigados anteriormente que são potencialmente importantes para inflamação gi e reparação de feridas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Garantir biópsias consistentes e precisas, bem como medidas de tamanho da ferida são de suma importância ao tentar avaliar efetivamente a taxa de fechamento da ferida neste modelo. Portanto, várias medidas devem ser tomadas para ter certeza de que os procedimentos estão sendo realizados corretamente. Primeiro, a profundidade da biópsia não deve ser muito rasa ou profunda. Se for muito raso, não haverá uma janela suficiente para avaliar o fechamento da ferida. A Figura 2 demonstra um…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Crohn’s and Colitis Foundation (D.C.M) e da Fundação Crohn de Nova York (D.C.M. e A.J.D.). Os autores agradecem à sra. Carmen Ferrara pela ajuda na criação do acompanhamento do vídeo deste artigo.
Materials
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
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