Durchführen von colonoscopic-Guided Pinch Biopsien bei Mäusen und Bewertung nachfolgender Gewebeveränderungen
Summary
Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens zur Induzieren von kolonoskopisch geführten Pinch-Biopsien bei Mäusen und verfolgen Denkwunden in Echtzeit. Zusätzlich werden Methoden zur Herstellung von Geweben für histologische, immunhistochemische und molekulare Analysen des Wundbettes bereitgestellt.
Abstract
Das Verständnis der Gewebe- und Zellveränderungen, die sowohl bei der akuten Verletzungsreaktion als auch während des Wundheilungsprozesses auftreten, ist von größter Bedeutung bei der Untersuchung von Erkrankungen des Magen-Darm-Traktes (GI). Das murine Kolosonnenbiopsiemodell ist ein nützliches Werkzeug, um diese Prozesse zu definieren. Zusätzlich kann das Zusammenspiel zwischen Darm-Luminal-Gehalt (z.B. Mikroben) und dem Dickdarm untersucht werden. Die Wundinduktion und die Fähigkeit, den Wundverschluss im Laufe der Zeit zuverlässig zu verfolgen, können jedoch eine Herausforderung darstellen. Darüber hinaus muss die Gewebevorbereitung und -orientierung standardisiert erfolgen, um histologische und molekulare Veränderungen optimal abzuhören. Hier stellen wir eine detaillierte Methode vor, die biopsieinduzierte Verletzungen und die Überwachung des Wundverschlusses durch wiederholte Koloskopien beschreibt. Es wird ein Ansatz beschrieben, der konsistente und reproduzierbare Messungen der Wundgröße, die Fähigkeit, das Wundbett für molekulare Analysen zu sammeln sowie das Wundbett beim Schnitt von Geweben zu visualisieren, sicherstellt. Die Fähigkeit, diese Techniken erfolgreich durchzuführen, ermöglicht Studien über die akute Verletzungsreaktion, Wundheilung und Luminal-Host-Wechselwirkungen innerhalb des Dickdarms.
Introduction
Der Magen-Darm-Trakt (GI) ist ein komplexes Organsystem mit seinen vielfältigen Funktionen, Wirtszelltypen (z.B. Epithel, Immun, Stromal, etc.) sowie Billionen von Mikroben. Angesichts dieser Komplexität beinhalten Krankheiten des GI-Traktes oft das Zusammenspiel all dieser Faktoren. Zum Beispiel, entzündliche Darmerkrankungen (IBD) sind mit Zyklen der Entzündung und Remission im GI-Trakt verbunden, mit der Aktivierung von entzündlichen Zellen, Dysbiose, und epitheliale Reparatur1,2,3,4,5,6,7. Geeignete Modellsysteme zur Untersuchung von IBD und anderen entzündlichen Erkrankungen des GI-Traktes ist entscheidend für die Aufklärung der Pathogenese von Krankheiten. Es gibt mehrere Modelle zur Untersuchung der IBD-Pathogenese, einschließlich gentechnisch veränderter Mäuse und der Verwendung von Chemikalien wie Dextran-Natriumsulfat (DSS) bei Nagetieren8,9,10. Zu den Einschränkungen dieser Modelle gehören die Unfähigkeit, die Induktion von Entzündungen genau zu kontrollieren, sowie Schwierigkeiten bei der Beurteilung der Wundheilung. Alternative Methoden zur Nachahmung von Aspekten der IBD-Pathogenese könnten sich als nützlich für die Entwicklung von Therapien erweisen.
Kolonoskopisch geführte Pinch-Biopsien bei Mäusen bieten ein nützliches Modellsystem, um die Pathogenese der Entzündungsreaktion, Wundheilung sowie Wirt-Mikroben-Wechselwirkungen im Dickdarm zu untersuchen. Dieser Ansatz wurde erstmals als experimentelles Werkzeug im Jahr 2009 verwendet, das seine Nützlichkeit für die Untersuchung der akuten Entzündungsreaktion und Wundheilung im Darm11demonstrierte. Nachfolgende Studien nutzten diese Technik, um die Rollen der verschiedenen Signalwege sowie der Darmmikrobiota, in der Darmwundheilung11,12,13,14,15,16,17,18. In jüngerer Zeit nutzte unsere Gruppe dieses Modell, um die Bedeutung von Sphingosin-1-Phosphat-Signalisierung und Bakterien in der akuten Reaktion auf Darmverletzungen zu untersuchen19. Obwohl nützlich, kann die Durchführung von kolonoskopisch geführten Pinch-Biopsien bei Mäusen und die Bewertung nachfolgender Gewebeveränderungen technisch eine Herausforderung darstellen. Zum Beispiel kann die Perforation des Darms bei der Induktion von Verletzungen auftreten und die Sicherstellung konsistenter Messungen des Wundbettes durch serielle Koloskopien kann schwierig sein. Darüber hinaus kann es schwierig sein, das Kolosgewebe richtig zu orientieren, um das Wundbett für histologische oder immunhistochemische Analysen zu visualisieren. Obwohl einige Informationen über diese Methoden existieren18,20, eine präzise schrittweise Beschreibung dieser Techniken entlang wird visuelle Hilfsmittel verspricht, die Zuverlässigkeit und breiteren Nutzen dieses Modells zu verbessern. Hier stellen wir eine detaillierte Methode zur Durchführung von kolonoskopisch geführten Pinch-Biopsien bei Mäusen vor, verfolgen den Wundverschluss im Laufe der Zeit und bereiten das Gewebe so vor, dass histologische und molekulare Analysen des Wundbettes möglich sind. Die Erstellung einer Standardmethode zur Durchführung dieser Techniken kann die Verwendung dieses Modells erweitern, um zuvor nicht untersuchte Mediatoren zu untersuchen, die potenziell wichtig für GI-Entzündungen und Wundreparaturen sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Sicherstellung konsistenter und genauer Biopsien sowie Messungen der Wundgröße sind von größter Bedeutung, wenn versucht wird, die Rate des Wundverschlusses in diesem Modell effektiv zu bewerten. Daher sollten mehrere Maßnahmen ergriffen werden, um darauf zu vertrauen, dass die Verfahren ordnungsgemäß durchgeführt werden. Erstens darf die Tiefe der Biopsie nicht zu flach oder tief sein. Wenn zu flach, wird es nicht genügend Fenster, um Wundverschluss zu bewerten. Abbildung 2 zei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Crohn es and Colitis Foundation (D.C.M) und der New York Crohn es Foundation (D.C.M. und A.J.D.) unterstützt. Die Autoren danken Frau Carmen Ferrara für die Unterstützung bei der Erstellung der Videobegleitung zu diesem Artikel.
Materials
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
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