Effectuer des biopsies de pincement guidées par colonoscopique chez la souris et évaluer les changements ultérieurs des tissus
Summary
Ici, nous fournissons une description détaillée de la procédure pour induire des biopsies de pincement colonoscopique-guidées chez les souris et suivre la fermeture de blessure en temps réel. En outre, des méthodes pour la préparation des tissus pour des analyses histologiques, immunohistochimiques et moléculaires du lit de blessure sont fournies.
Abstract
Comprendre les changements tissulaires et cellulaires qui se produisent dans la réponse aux blessures aiguës ainsi que pendant le processus de cicatrisation des plaies est d’une importance primordiale lors de l’étude des maladies du tractus gastro-intestinal (IG). Le modèle de biopsie de pincement du côlon murin est un outil utile pour définir ces processus. En outre, l’interaction entre la teneur en luminal intestinal (p. ex., les microbes) et le côlon peut être étudiée. Cependant, l’induction des plaies et la capacité de suivre la fermeture des plaies au fil du temps d’une manière fiable peuvent être difficiles. De plus, la préparation et l’orientation des tissus doivent être effectuées de manière normalisée afin d’interroger de façon optimale les changements histologiques et moléculaires. Ici, nous présentons une méthode détaillée décrivant des dommages biopsie-induits et la surveillance de la fermeture de blessure par des coloscopies répétées. Une approche est décrite qui assure des mesures cohérentes et reproductibles de la taille des plaies, la capacité de recueillir le lit de plaie pour des analyses moléculaires ainsi que de visualiser le lit de la plaie lors de la section des tissus. La capacité d’effectuer avec succès ces techniques permet d’effectuer des études sur la réponse aiguë aux blessures, la cicatrisation des plaies et les interactions luminal-hôte dans le côlon.
Introduction
Le tractus gastro-intestinal (IG) est un système d’organes complexe compte tenu de ses multiples fonctions, des types de cellules hôtes (p. ex. épithéliales, immunitaires, stromal, etc.) ainsi que des milliards de microbes. À la lumière de cette complexité, les maladies du tractus gastro-intestinal impliquent souvent l’interaction de tous ces facteurs. Par exemple, les maladies inflammatoires de l’intestin (MII) sont associées à des cycles d’inflammation et de rémission dans le tractus gastro-intestinal, impliquant l’activation de cellules inflammatoires, la dysbiose et la réparation épithéliale1,2,3,4,5,6,7. Il est essentiel d’avoir des systèmes modèles appropriés pour étudier les MII et d’autres affections inflammatoires du tractus gastro-intestinal pour élucider la pathogénie de la maladie. Plusieurs modèles existent pour étudier la pathogénie des MII, y compris les souris génétiquement modifiées et l’utilisation de produits chimiques tels que le sulfate de sodium dextran (DSS)chez les rongeurs 8,9,10. Les limites de ces modèles incluent une incapacité de contrôler avec précision l’induction de l’inflammation aussi bien que des difficultés en évaluant la guérison de blessure. D’autres méthodes pour imiter des aspects de la pathogénie d’IBD pourraient s’avérer utiles pour développer des thérapies.
Les biopsies de pincement colonoscopique-guidées chez les souris offrent un système modèle utile pour étudier la pathogénie de la réponse inflammatoire, la guérison de blessure, aussi bien que les interactions d’hôte-microbe dans le côlon. Cette approche a été utilisée pour la première fois comme outil expérimental en 2009, ce qui a démontré son utilité pour étudier la réponse inflammatoire aiguë et la cicatrisation des plaies dansl’intestin 11. Des études ultérieures ont utilisé cette technique pour évaluer les rôles des différentes voies de signalisation ainsi que le microbiote intestinal, dans la cicatrisation des plaies du côlon11,12,13,14,15,16,17,18. Plus récemment, notre groupe a utilisé ce modèle pour étudier l’importance de la signalisation sphingosine-1-phosphate et des bactéries dans la réponse aiguë aux dommages du côlon19. Bien qu’utile, effectuer des biopsies de pincement colonoscopiques-guidées chez les souris et évaluer des changements ultérieurs de tissu peut être techniquement provocant. Par exemple, la perforation de l’intestin peut se produire lors de l’induction des blessures et de s’assurer que des mesures cohérentes du lit de la plaie par des coloscopies en série peuvent être difficiles. En outre, orienter le tissu du côlon correctement pour visualiser le lit de la plaie pour des analyses histologiques ou immunohistochimiques peut être difficile. Bien que certaines informations existent sur ces méthodes18,20, une description précise étape-sage de ces techniques le long sera aides visuelles promet d’améliorer la fiabilité et l’utilité plus large de ce modèle. Ici, nous présentons une méthode détaillée pour effectuer des biopsies de pincement colonoscopiques-guidées chez les souris, suivre la fermeture de blessure au fil du temps et préparer le tissu pour permettre des analyses histologiques et moléculaires du lit de blessure. La création d’une méthode standard pour effectuer ces techniques peut étendre l’utilisation de ce modèle pour étudier les médiateurs précédemment non étudiés qui sont potentiellement importants pour l’inflammation gastro-intestinale et la réparation des plaies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est d’une importance primordiale d’assurer des biopsies cohérentes et précises ainsi que des mesures de la taille des plaies lorsqu’on tente d’évaluer efficacement le taux de fermeture des plaies dans ce modèle. Par conséquent, plusieurs mesures devraient être prises pour être sûr que les procédures sont correctement exécutées. Premièrement, la profondeur de la biopsie ne doit pas être trop peu profonde ou profonde. S’il est trop peu profond, il n’y aura pas une fenêtre suffisante pour évalu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Crohn’s and Colitis Foundation (D.C.M) et de la New York Crohn’s Foundation (D.C.M. et A.J.D.). Les auteurs remercient Mme Carmen Ferrara pour leur aide dans la création de l’accompagnement vidéo de cet article.
Materials
| Biopsy forceps, 3 Fr | Karl Storz | 61071ZJ | |
| Coloview Tower system | Karl Storz | contact company | |
| Examination sheath, 9 Fr, Kit | Karl Storz | 61029DK | |
| Hopkins telescope, 0', 1.9 mm x 10 cm | Karl Storz | 64301AA | |
| isofluorane | Covetrus | 2905 | |
| methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| micro iris scissors | Integra | 18-1619 | |
| NIH ImageJ | NIH | N/A | software available for free download from: https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Pawfly MA-60 aquarium pump | Amazon | N/A | |
| scalpal with #10 blade | Hill-Rom | 372610 |
References
- Boal Carvalho, P., Cotter, J. Mucosal Healing in Ulcerative Colitis: A Comprehensive Review. Drugs. 77 (2), 159-173 (2017).
- Chen, M. L., Sundrud, M. S. Cytokine Networks and T-Cell Subsets in Inflammatory Bowel Diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1157-1167 (2016).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Halfvarson, J., et al. Dynamics of the human gut microbiome in inflammatory bowel disease. Nature Microbiology. 2, 17004 (2017).
- Johansson, M. E., et al. Bacteria penetrate the normally impenetrable inner colon mucus layer in both murine colitis models and patients with ulcerative colitis. Gut. 63 (2), 281-291 (2014).
- Luissint, A. C., Parkos, C. A., Nusrat, A. Inflammation and the Intestinal Barrier: Leukocyte-Epithelial Cell Interactions, Cell Junction Remodeling, and Mucosal Repair. Gastroenterology. 151 (4), 616-632 (2016).
- Pineton de Chambrun, G., Blanc, G., Peyrin-Biroulet, L. Current evidence supporting mucosal healing and deep remission as important treatment goals for inflammatory bowel disease. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 10 (8), 915-927 (2016).
- Fung, K. Y., Putoczki, T. In Vivo Models of Inflammatory Bowel Disease and Colitis-Associated Cancer. Methods in Molecular Biology. 1725, 3-13 (2018).
- Jurjus, A. R., Khoury, N. N., Reimund, J. M. Animal models of inflammatory bowel disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (2), 81-92 (2004).
- Mizoguchi, A., Takeuchi, T., Himuro, H., Okada, T., Mizoguchi, E. Genetically engineered mouse models for studying inflammatory bowel disease. Journal of Pathology. 238 (2), 205-219 (2016).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (1), 256-261 (2009).
- Alam, A., et al. The microenvironment of injured murine gut elicits a local pro-restitutive microbiota. Nature Microbiology. 1, 15021 (2016).
- Alam, A., et al. Redox signaling regulates commensal-mediated mucosal homeostasis and restitution and requires formyl peptide receptor 1. Mucosal Immunology. 7 (3), 645-655 (2014).
- Kuhn, K. A., Manieri, N. A., Liu, T. C., Stappenbeck, T. S. IL-6 stimulates intestinal epithelial proliferation and repair after injury. PLoS One. 9 (12), 114195 (2014).
- Leoni, G., et al. Annexin A1, formyl peptide receptor, and NOX1 orchestrate epithelial repair. Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 443-454 (2013).
- Manieri, N. A., et al. Mucosally transplanted mesenchymal stem cells stimulate intestinal healing by promoting angiogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3606-3618 (2015).
- Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury. Science. 338 (6103), 108-113 (2012).
- Neurath, M. F., et al. Assessment of tumor development and wound healing using endoscopic techniques in mice. Gastroenterology. 139 (6), 1837-1843 (2010).
- Montrose, D. C., et al. Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice as a Useful Model for Evaluating the Roles of Host and Luminal Factors in Colonic Inflammation. American Journal of Pathology. 188 (12), 2811-2825 (2018).
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. Journal of Visualized Experiments. (90), (2014).
