Bリンパ球活性化を研究するための牽引力顕微鏡

1. ゲル調製 ゲル支持体のシラナイゼーション 2分間のUVランプ(残留オゾンへの暴露を避けるためにUVランプへの暴露前に30 s待つ)で、カバースリップまたはガラス底ペトリ皿(ゲルサポートとして使用されます)をアクティブにします。 200 μL のアミノプロピルトリメトキシシラン (APTMS) を使用して、カバースリップ/ガラス底皿を 5 分間シラナイズします。これにより、ゲルの共有結合に対する支持体を準備する。 カバースリップ/ガラス底皿を超純水で十分に洗います。 真空吸引を使用してカバースリップ/ガラス底皿を乾燥させます。 ゲルを平らにするために使用される18mmカバースリップの準備 カバースリップを準備するには、まずセラミックカバースリップホルダーに入れます。その後、カバースリップホルダーを小さなビーカー(50 mL)に入れ、カバーリップの上にシリコン化試薬(4°Cで保存され、再利用可能)を注ぎ、それらを完全に覆うことを確認します。 ビーカーをアルミホイルで覆い、室温で3分間インキュベートします。待っている間に、超純水で大きなビーカー(500 mL)を満たします。シリコン化試薬でインキュベーションを3分経過した後、カバースリップホルダーをカバースリップで水のビーカーに移します。 カバーリップを超純水で徹底的に洗い流し、よく乾燥させ、紙の拭き取りを続けます。最良の結果を得るには、次のセクションに進んでください。 ゲル重合 0.5 kPaのゲルの場合、40%アクリルアミドの75 μLを30 μLの2%ビサクリアミド(架橋剤)と895 μLのリン酸緩衝生理食塩(PBS)と混合します。このプレミックスは、4°Cで1ヶ月まで保存することができます。 0.5 kPaゲルプレミックスの167 μLに、1%(1.67 μL)のビーズ、ボルテックス、超音波処理をバスソニケーター(50-100 Wのパワーと周波数40 kHzの標準ベンチ超音波洗浄機)に5分間追加します。アルミニウムホイルを使用して光から保護されたミックスを保ちます。注: プレミックスは、イニシエータ(TEMED)が追加されるまで重合しません。 重合を触媒するには、1%(1.67 μL)を10%w/v過硫酸アンモニウム(APS)に加えます。 重合を開始するには、0.1%(0.2 μL)N、N、N、N′、N’-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)を加えます。ピペットと混ぜます。APSとTEMEDを添加すると、ゲルは急速に重合するので、ゲル鋳造に迅速に進みます。 ゲル鋳造 各カバースリップ/ガラス底皿にゲルミックスのピペット9 μL(中央に落とし、図1A) シラナイズ/疎水性カバースリップを配置し、ゲルを平らにします(図1B)。鉗子を使用して、カバースリップを押して、漏れ出し始めるまでカバースリップの全領域(図1C)にゲルが広がるようにします。 カバースリップ/ガラス底皿を大きなペトリ皿に反転させ、ベンチでタップして、ゲル表面に向かうビーズを強制的に押し付けます(図1D)。 アルミニウム箔で覆い、湿度の高いチャンバーで室温で重合するために1時間放置します(すなわち、蒸発を防ぐために皿の上に濡れた組織を置きます)。 1時間後、カバースリップの放出を容易にするためにサンプルにPBSを加える。慎重に、針を使用してカバースリップを取り外します(異なるシランを塗布すると、ゲルからカバースリップを簡単に剥がす必要があります、図1E)。 ゲルをPBSに残します。注意:ゲルは4°Cで5〜7日間PBSに保存できるようになりましたが、48時間以内に使用することをお勧めします。 2. ゲルの機能化 スルフォスクシニミジル6-(4′-アジド-2′-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノエート(スルフォSANPAH)溶液を10 mM HEPESバッファーで0.5mg/mLで調製します。アルミ箔で覆われた4°Cで1週間まで保存できます。 ゲルからPBSを吸引する。 室温でゲルにスルフォSANPAHの150 μLを加える(図1F)。 ゲルを2分間UV処理に当て、スルフォSANPAHの部位を光活性化し、ゲル表面に貼り付けます。 PBSで3回洗浄します(図1G)。 ステップ 2.2 ~ 2.5 を繰り返します。 250 μL (100 μg/mL) を各ゲルに加え、アルミニウムホイルで覆ったまま、一晩4°Cの湿気の多いチャンバーで一晩インキュベートします(図1H)。 HEL抗原を除去し、PBSで3回洗浄します。注:HELは抗原として、そして接着分子として作用します。受容体に結合する他の分子(例えば、抗マウスIgM、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン)またはインテグリンリガンド(例えば、LFA1に結合するICAM1)と混合することができる。必要に応じて、抗原抽出は、HELの蛍光版(タンパク質標識キットで分子を染色することによって得られる、ステップ4を参照)で観察することができる。バルクでの特定の濃度は、ガラス上と同じ表面濃度をゲルに得ない可能性があることに注意してください:直接比較が必要な場合は、二次染色で定量する必要があります。 3. 細胞のローディングとイメージング イメージングの前に、ゲルからPBSを取り出し、500 μLのB細胞培地(RPMI 1640、10%非補体胎児仔血清、1%ペニシリンストレプトマイシン、2%ピルビン酸ナトリウム、50uMメルカプトエタノールおよび1X非必須アミノ酸)を添加し、RTに平衡化させます。 細胞製剤 負の選択プロトコルに従って脾臓から原発B細胞を精製する(材料表を参照)。典型的な最終的なB細胞収量は1 x 107細胞の周りです。これをB細胞培地(RPMI-1640は10%の胎児の子牛血清、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、0.1%メルカプトエタノールおよび2%ピルビン酸ナトリウムを補充する)に濃縮する。 必要に応じて、4°Cで最大6時間保存します。 画像取得前に37°Cで30分間セルを保持します。 イメージング 熱および(おそらく)CO2 制御と共焦点顕微鏡を使用してください。注意: 共焦点顕微鏡と回転ディスク顕微鏡のどちらを使用するかに関係なく、ピクセルサイズ<200 nmを使用して解析フェーズ(60x、NA 1.3など)でビーズを快適に追跡できる目的/ピンホールを使用することが重要です。蛍光顕微鏡も使用できますが、信号対ノイズ比が低く、個々のビーズの追跡が困難になる可能性があります。 ビーズの2つの主要な層は、ゲルの底部と上部に表示されます。ゲル平面に焦点を当てます。注:素敵なゲルは星空として現れ、ビーズはほぼ同じ平面上にほぼ均一に分布します。 フレームレート5sで30分間の取得をプログラムします(これは実験のニーズに適応可能です、例えば、他の色を獲得し、zスタックを獲得するなど) ゲルから培地を吸引し、約200μLの培地をゲルに残します。ゲルを顕微鏡に置き、ビーズの表面層とゲル上の素敵な均一な領域を見つけます。 80 μLの細胞を加えます(焦点を維持するためにゲルに触れないようにしてください)。 フォーカスが正しく、セルがエリア内で降下 (透過光の下) に表示されることを確認します。細胞がゲルに到達する前に取得を開始します。 ゲル、振動、フォーカスドリフトとの偶発的な接触の場合は、フォーカスを調整します。注:リラックスしたゲルの画像を収集することが重要であり、これはゲルに細胞が到着する前に撮影された任意の画像であることができます。 4. 蛍光HEL抽出実験 蛍光色素(Alexa 555などのビーズとは異なる色)を結合して蛍光HELを調製し、 材料表を参照してください。 ステップ2.7では、従来のHELを蛍光HELと交換する。 光の漂白を避けるために、低照度設定または低フレームレート(例えば、毎分2フレーム)で画像を取得します。 HEL 抽出を定量化するには、次の式に従ってフレーム 0 の強度I(0) によって補正および正規化された各フレームI(t)のセル領域に積み込まれた強度を計算します。注:フルオロフォアと共役した抗原は見えませんが(おそらくゲル表面でのフルオロフォアの焼入れによる)、ゲル上の存在は抗HELおよび蛍光二次抗体で確認できます。この蛍光体は、抗HELを塗布したカバースリップでゲルから剥がし、二次蛍光抗体(カバースリップ上)6で明らかにすることで、その蛍光性が実際に蛍光であることが確認できる。抽出された抗原のシグナルは非常に薄暗く、ビーズの漏出によってマスクされることもある。抗原抽出のみに関心がある場合は、ビーズを使わずにゲルを調製することをお勧めします(ステップ1.3.2および1.4.3を省略)。 5. 蛍光イメージング 野生型(例えば、ライフアクトGFPまたはミオシンII GFPマウスから)に対して行われた遺伝子組み換えマウスの脾臓からB細胞を精製することにより、蛍光B細胞を得る。 蛍光細胞のイメージングには、(可能であれば)水浸漬長距離40x-100x目的を有する回転ディスク顕微鏡を使用します。 露出時間とフレームレートを低く抑え、漂白を防ぐ。注:Zの点広がり関数はゲルの存在によって非常に劣化するため、水浸しの目的を使用することをお勧めします。水浸漬目的を持つ生直立顕微鏡は、放出経路に(球状)細胞(および細胞核)が存在することによって誘導される強い球面収差に苦しんでいる。 6. 分析 注:データ分析は、一般的に、ドリフトのためにスタック全体を修正し、各フレーム内のビーズを見つけ、参照フレームに対するそれらの動きを追跡し(細胞の不在時に撮影)、変位場を補間し、フーリエ変換29を使用して応力を得る問題を反転させることによって行われます。このため、オンラインリポジトリ30からダウンロード可能なImageJマクロとMATLABプログラムの組み合わせを使用することをお勧めします。 イメージのスタックとして ImageJ でムービーを開く マクロ “Crop_and_save.ijm” を実行します。 「長方形」ツールで対象地域(ROI)を選択し、’t’キーを使用してROIリストに追加します。 セルをトリミングする場合は、不動ビーズの領域を 5 ~ 10 ピクセル以上含める必要があります。境界または他のセルに近すぎるセルを分析から除外します。終了したら「OK」をクリックします。 マクロはセルのマスクを提案します: これが満足のいく場合は「OK」をクリックします。問題がなければ、[OKでない]をクリックし、選択ツール(例:”フリーハンド”または”Oval”)で閉じた領域を手動で選択し、[続行]をクリックします。 MATLAB を開き、”TFM_v1.m” を実行します。 必要なパラメータを入力する:特に画像のプロパティ(ピクセルサイズ、取得時間間隔)とゲルのプロパティ(ヤングモジュラスE、ポアソン比)を確認してください。 参照イメージは、デフォルトで最初に設定されます。必要に応じて別のフレームに設定するか、外部ファイルをロードするには「0」に設定します。 元のファイルと同じディレクトリにソフトウェアの出力を見つけます(説明については、User_notice.pdfファイルを参照)。これには、ビーズの予備トラック(「FILENAME.fig」)、時間の経過に伴う収縮エネルギーのプロット(「FILENAME_energy.fig」)、セル(エネルギー、面積、瞬間など FILENAME_finaltable)に統合されたいくつかの量のテーブル(エネルギー、面積、瞬間など)、変位と力場を含む構造、ビーズの映画、変位場、ストレスとエネルギー(任意のaviリーダーで開くことができる)が含まれます。注: 入力パラメータでは、「窓サイズ」は変位が補間される窓であり、従って応力と変位場の最終的な解像度です。これは、少数の(デフォルトでは4)ピクセルに設定されています。ビーズがない領域を補間して、人為的に解像度を上げるため、これを減らすことは推奨されません。