Изоляция кардиомиоцитов от фиксированных сердец для иммуноцитохимии и анализа плоидии
Summary
Целью этой работы является разработка метода воспроизводимой изоляции кардиомиоцитов от взрослого сердца и измерения содержания и нуклеации ДНК.
Abstract
Сердце взрослого млекопитающего состоит из различных типов клеток, включая кардиомиоциты, эндотелиальные клетки и фибробласты. Так как трудно надежно определить ядра кардиомиоцитов на гистологических участках, многие группы полагаются на изоляцию жизнеспособных кардиомиоцитов до фиксации для выполнения иммуностения. Тем не менее, эти живые методы изоляции кардиомиоцитов требуют оптимизации, чтобы максимизировать урожайность, жизнеспособность и качество образцов, с присущими колебаниям от образца к образцу, несмотря на максимальную оптимизацию. Здесь мы сообщаем воспроизводимый протокол, включающий фиксацию до энзиматического пищеварения сердца, что приводит к максимальной урожайности при сохранении морфологии виво отдельных кардиомиоцитов. Мы также разработали автоматизированную платформу анализа для определения количества ядер и содержания ДНК на ядро для отдельных кардиомиоцитов. После разоблачения грудной полости, сердце было арестовано в диастоле перфузией с 60 мМ ККл в PBS. Затем сердце было зафиксировано в растворе параформальдегида (PFA), а затем переварено раствором коллагеназы 60 мг/мл. После пищеварения клетки были сингуляризованы тритурацией, а фракция кардиомиоцитов обогащалась с помощью дифференциальной центрифугации. Изолированные кардиомиоциты были окрашены для Troponin T α-актинина для оценки чистоты полученной популяции. Кроме того, мы разработали платформу анализа изображений для определения нуклеации кардиомиоцитов и статуса плоиди после окрашивания DAPI. Оценки, основанные на изображениях, привели к последовательным и воспроизводимым результатам. Таким образом, с помощью этого протокола можно сохранить родную морфологию отдельных кардиомиоцитов, чтобы позволить иммуноцитохимии и анализа содержания ДНК при достижении максимальной урожайности.
Introduction
Сердечные заболевания были основной причиной смерти в большинстве западных стран на протяжении многих десятилетий1,2. Хотя многие улучшения в лечении сердечно-сосудистых заболеваний улучшили выживание, Есть в настоящее время нет лечения, которые могут заменить потерянные кардиомиоциты. Таким образом, исследования, связанные с функцией кардиомиоцитов, пролиферации, апоптоза и гипертрофии были и продолжают быть одним из основных направлений научного сообщества. Так как сердце взрослого млекопитающего имеет очень ограниченную регенеративную способность, с оценочной скоростью обновления кардиомиоцитов менее 1% в год, крайне важно надежно определить кардиомиоциты пролиферативныхсобытий 3,4. Большинство стратегий, которые измеряют пролиферативные события, полагаются либо на окрашивание для включенных аналогов нуклеотида ДНК для оценки предыдущего или текущего распространения, либо пятно на ядерных маркерахактивного распространения 5. Особенно важно надежно определить пролиферативные события кардиомиоцитов, так как общее количество пролиферативных кардиомиоцитовнастолько низко 3,,6. Например, на основе 1% скорость обновления эндогенных кардиомиоцитов в год, можно ожидать, чтобы найти между 25 и 50 кардиомиоцитов, которые будут пролиферативы в любой момент времени во взросломсердце мыши 7,8. Любые неточности в идентификации ядер кардиомиоцитов могут привести к ложноположим результатам. Поэтому крайне важно надежно определить ядра кардиомиоцитов, которые оказались сложными и ненадежными из гистологических разделов9. Идентификация кардиомиоцитов является гораздо более точным из одиночных клеток, чем из тканей разделов, как это может быть трудно отличить кардиомиоцитов от других типов клеток, даже при использовании маркеров, таких как α-актинин, хотя PCM1 может быть надежным маркером ядер кардиомиоцитов в гистологическихразделах 10.
Текущие протоколы полагаются на изоляцию живых кардиомиоцитов до фиксации, которая, как известно, приводит к смерти по крайней мере 30% кардиомиоцитов, и может привести к непреднамеренному отбору конкретных популяций кардиомиоцитов11. Кроме того, эти протоколы, как известно, трудно оптимизировать, чтобы обеспечить воспроизводимые результаты. Даже оптимизированные методы изоляции, как правило, могут производить не более 65% живых, стержневидных кардиомиоцитов с различнойурожайностью 12.
Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали протокол, который позволяет исследователям изолировать фиксированные кардиомиоциты. Так как образцы фиксируются до изоляции, урожайность максимизируется, и морфология in vivo хорошо сохраняется. Кроме того, с помощью этого протокола можно изолировать кардиомиоциты из клинических образцов, которые обычно фиксируются сразу после закупки. Кроме того, для выявления вновь генерируемых кардиомиоцитов, важно измерить нуклеацию и статус плоиди отдельных кардиомиоцитов, так как только диплоидные кардиомиоциты, как правило, предполагается, что вновь образованные. Цитометрия потока не может отличать мультинуклеацию от полиплоидии и является относительно трудоемким протоколом. Ручное изложение и измерение ядер в изображениях является очень низкой пропускной способностью и подвержено человеческому уклону. Автоматизированная количественная оценка изображений фиксированных, изолированных кардиомиоцитов DAPI решает обе эти проблемы. Определение нуклеаций и плоидных дистрибутивов на основе изображений может быть получено с минимальным временем и реагентами с использованием основного оборудования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Поскольку кардиомиоциты не могут поддерживаться в культуре, важно изолировать первичные кардиомиоциты, чтобы иметь возможность изучать их архитектуру и функции11. Таким образом, методы изоляции кардиомиоцитов широко используются в сердечной области. Если цель состоит в том, чтобы определить функциональные аспекты кардиомиоцитов, важно изолировать жизнеспособные кардиомиоциты. Эти живые кардиомиоциты также могут быть использованы для выполнения иммуностимуляторов на изолированных кардиомиоцитов. Тем не менее, оптимизация техники изоляции живых кардиомиоцитов является технически сложной задачей, и даже лучшие методы, как правило, дают только 60-65% живых стержней формы кардиомиоцитов, а остальные кардиомиоциты все balled и умираетили мертвых 11,12. Здесь мы разработали методику, которая позволит исследователям сначала исправить сердце, а затем эффективно изолировать кардиомиоциты. Этот новый протокол позволяет гораздо более высокие урожаи стержнеобразных кардиомиоцитов по сравнению с ранее опубликованными протоколами. Кроме того, мы разработали платформу анализа изображений для классификации кардиомиоцитов автоматически на основе нуклеации и плоидии. С помощью этих новых методологий, группы могут пятно кардиомиоцитов для различных белков, и изучение кардиомиоцитов плоидии и нуклеации статус суррогатов для регенеративного потенциала сердца.
Описанный здесь протокол относительно прост и может выполняться без какого-либо современного оборудования. Количество коллагеназы и инкубации время для пищеварения может варьироваться в зависимости от партии коллагеназы, и компания, предоставляющая его. Мы использовали коллагеназы типа 2, так как это наиболее широко используется для переваривания сердца для получения живых кардиомиоцитов. Основываясь на наших наблюдениях, мы определили, что ночная инкубация с коллагеназой типа 2 60 мг/мл является оптимальной практически для всех мышей, независимо от уровня фиброза. У нас никогда не было проблемы переварения, так как внутриклеточные белки фиксируются и не так доступны, как внеклеточный коллаген. Однако, если сердце не переваривается должным образом, более энергичные тритурации могут быть необходимы, что вызывает фрагментацию клеток из-за стресса снятия свия. Таким образом, очень важно, чтобы убедиться, что сердце переваривается должным образом, прежде чем перейти к тритурации. Твердость сердца может быть проверена путем сжатия с типсами для оценки степени пищеварения. После инкубации с коллагеназой, сердца должны быть менее жесткими и легко разорвать на части. Другие виды коллагеназы также могут быть использованы. В предыдущем докладе использовалась комбинация коллагеназы B и D14.
Кроме того, мы считаем, что этот протокол может быть использован для оценки общего числа кардиомиоцитов в сердце15. Однако, если цель состоит в том, чтобы получить и количественно все кардиомиоциты из сердца, важно инкубировать сердца в течение длительных периодов времени в растворе коллагеназы (например, 3-7 дней), где раствор коллагеназы должен пополняться один раз в день. Это позволит свести к минимуму несоответствия в эффективности изоляции, устраняя влияние степени тритурации на урожайность кардиомиоцитов.
Использование содержания ДНК для измерения плоидии не является новым, и был использован в цитометрии потока на протяжении десятилетий. Недавно было показано, что микроскопия может аналогичным образом использоваться для оценки содержания ДНК на ядро16. Здесь мы реализовали эту стратегию для измерения плоидии ядер кардиомиоцитов, как суррогат для вновь образованных кардиомиоцитов. Догма в области сердечной регенерации заключается в том, что только мононуклеированные, диплоидные кардиомиоциты могут проходить цитокинез и давать новые кардиомиоциты. Так как это очень сложно измерить новое образование кардиомиоцитов в виво, изолируя кардиомиоциты, которые преследовали после введения аналога нуклеотида ДНК и определения уровня мононуклеированных, диплоидных кардиомиоцитов был использован в качестве приближения способности сердца генерировать новыекардиомиоциты 17. Здесь мы предоставляем макрос для ImageJ, который позволяет легко количественно кардиомиоцитов ploidy. Как минимум, для получения точной оценки местоположения пика G1 необходимо измерить 500 ядер. Если принять меры для обеспечения того, чтобы окрашивание и визуализация условия согласуются в каждом хорошо изображенной пластины, только 500 ядер по всей выборке должны быть изображены, в противном случае, там должно быть 500 ядер на изображениегруппы 18,19. Ограничения измерения нуклеации и плоидии на основе изображений включают трудности с разграничением ядер от клеток-адептов от фактических ядер кардиомиоцитов при использовании двумерных изображений. Такие адепт-клетки могут привести к завышению количества многоядерных клеток и снижению точности измерений популяции тетраплоидного кардиомиоцита. Одной из возможных стратегий для решения этой проблемы было бы использовать кардиомиоцитов ядерного маркера PCM16,20. Тем не менее, у нас возникли трудности, чтобы получить надежное окрашивание PCM1 на правильно закрепленных клеток или тканей.
Другим потенциальным ограничением является то, что некоторые изображения ядерных пятен могут иметь значительное фоновое цитоплазмическое окрашивание, предотвращая надлежащее пороговое значение с использованием фиджийских методов, построенных без обширной предварительной обработки. Кроме того, нерегулярный вклад этой фоновой флуоресценции в ploidy оценки снижает их точность. Кроме того, если клетки не остаются в растворе окрашивания ДНК в течение достаточного времени, флуоресцентный краситель не будет связываться с насыщением в ядрах и предположение о линейной взаимосвязи между ядерной интегрированной интенсивностью и содержанием ДНК больше не будет точным.
Следует отметить, что программное обеспечение не может сегментировать кардиомиоцитные кластеры и вместо этого удаляет их из анализа. Поэтому крайне важно семени кардиомиоцитов при относительно низкой плотности (например, 1000 клеток/см2). Кроме того, программное обеспечение не может различать два кардиомиоцитов выстроились из конца в конец и длинные, сингулярные кардиомиоциты. Такого рода кластеры могут ошибочно раздувать многоядерные оценки.
Хотя описанный метод не позволяет получить жизнеспособные кардиомиоциты и, таким образом, не может быть использован для измерения динамических клеточных процессов, если цель состоит в том, чтобы выполнить иммуностимунизацию, мы считаем, что описанный метод превосходит существующие протоколы с более высокими урожаями кардиомиоцитов и лучшим качеством с точки зрения морфологии и локализации белка. Наконец, описанный метод может быть использован для изоляции кардиомиоцитов из клиническихобразцов 14,21. Мы считаем, что описанная методология может помочь различным исследователям получить высококачественные кардиомиоциты и измерить нуклеацию и плоидию в качестве суррогатов для формирования новых кардиомиоцитов.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JHvB поддерживается гранты от NIH, регенеративной медицины Миннесота, и отдельные биомедицинские исследования премии от Хартвелл фонда.
Materials
| 96 wells plate for imaging | Corning | 3340 | We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging |
| Alpha actinin | Novus Biologicals | NBP1-32462 | This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres |
| Blunt scissors | Fine Scissor Tools | 14072-10 | We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
| CD-1 mice | Charles river | 22 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
| Collagenase 2 | Worthington | LS004177 | For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165-10G | For edu staining |
| Cy5 Picolyl Azide | Click Chemistry Tools | 1177-25 | Azide used for edu staining |
| Cytation3 | BioTek | – | Used for automated imaging for DNA analysis |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water. |
| donkey anti-mouse IgG-Alexa568 | Life Technologies | A10037 | Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes |
| Forceps | ROBOZ | RS-5137 | We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144212 | To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5 |
| ImageJ | imagej.net/Fiji/Downloads | – | Used for analyzing images |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 255564-100G | For edu staining |
| Needle for infusion | TERUMO | SV*23BLK | We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection |
| Nikon A1R HD25 | Nikon | – | Used to take confocal images of alpha actinin staining |
| Nylon mesh 200 micron | Elko filtering | 03-200/54 | Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied) |
| Nylon mesh 400 micron | Elko filtering | 06-400/38 | Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21-040-CV | This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it |
| Potassium chloride, Granular | Mallinckrodt | 6858 | Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature |
| R | r-project.org | – | Used for data analysis of the measurements obtained from images |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | Used to buffer EdU staining reaction |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135 (10), e146 (2017).
- Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the future of cardiovascular disease in the United States: a policy statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (8), 933-944 (2011).
- Eschenhagen, T., et al. Cardiomyocyte Regeneration: A Consensus Statement. Circulation. 136 (7), 680-686 (2017).
- Tzahor, E., Poss, K. D. Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart. Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).
- Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
- Richardson, G. D. Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
- Bergmann, O., et al. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental Cell Research. 317 (2), 188-194 (2011).
- O’Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Shaklee, J., et al. Development of a Click-Chemistry Reagent Compatible with Mass Cytometry. Scientific Reports. 8 (1), 6657 (2018).
- Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
- Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).
- Patterson, M., et al. Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration. Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).
- Gomes, C. J., Harman, M. W., Centuori, S. M., Wolgemuth, C. W., Martinez, J. D. Measuring DNA content in live cells by fluorescence microscopy. Cell Division. 13, 6 (2018).
- Woo, L. A., et al. High-content phenotypic assay for proliferation of human iPSC-derived cardiomyocytes identifies L-type calcium channels as targets. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 204-214 (2018).
- Morikawa, Y., Heallen, T., Leach, J., Xiao, Y., Martin, J. F. Dystrophin-glycoprotein complex sequesters Yap to inhibit cardiomyocyte proliferation. Nature. 547 (7662), 227-231 (2017).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
