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Biology

Isolamento de Cardiomiócitos de Corações Fixos para Imunocitoquímica e Análise ploidy

Published: October 07, 2020
doi:
10.3791/60938
, ,
1Department of Integrative Biology and Physiology,University of Minnesota, 2Lillehei Heart Institute, Department of Medicine,University of Minnesota, 3Stem Cell Institute,University of Minnesota

Summary

O objetivo deste trabalho é desenvolver um método para isolar os cardiomiócitos do coração adulto e medir o conteúdo e a nucleação do DNA.

Abstract

O coração de mamífero adulto é composto por vários tipos de células, incluindo cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos. Como é difícil identificar de forma confiável núcleos de cardiomiócitos em seções histológicas, muitos grupos dependem de isolar cardiomócitos viáveis antes da fixação para realizar imunostaining. No entanto, essas técnicas de isolamento do cardiomiócito vivo requerem otimização para maximizar o rendimento, a viabilidade e a qualidade das amostras, com flutuações inerentes de amostra para amostra, apesar da máxima otimização. Aqui, relatamos um protocolo reprodutível, envolvendo fixação prévia à digestão enzimática do coração, o que leva ao rendimento máximo, preservando a morfologia in vivo dos cardiomiócitos individuais. Desenvolvemos ainda uma plataforma de análise automatizada para determinar o número de núcleos e conteúdo de DNA por núcleo para cardiomiócitos individuais. Após expor a cavidade torácica, o coração foi preso em diastole por perfusão com 60 mM KCl na PBS. Em seguida, o coração foi fixado em solução de paraformaldeído (PFA) de 4%, e depois digerido com solução de colagenase de 60 mg/mL. Após a digestão, as células foram singularizadas pela trituração, e a fração de cardiomiócito foi enriquecida através da centrifugação diferencial. Cardiomiócitos isolados foram manchados para Troponin T e α-actinina para avaliar a pureza da população obtida. Além disso, desenvolvemos uma plataforma de análise de imagem para determinar a nucleação de cardiomiócitos e o estado ploidy após a coloração da DAPI. Avaliações ploidy baseadas em imagem levaram a resultados consistentes e reprodutíveis. Assim, com este protocolo, é possível preservar a morfologia nativa dos cardiomiócitos individuais para permitir a imunocitoquímica e a análise do conteúdo do DNA, ao mesmo tempo em que alcança o máximo rendimento.

Introduction

Doenças cardíacas têm sido a principal causa de morte na maioria dos países ocidentais por muitas décadas1,2. Embora muitas melhorias no tratamento de doenças cardiovasculares tenham melhorado a sobrevida, atualmente não há tratamentos que possam substituir cardiomiócitos perdidos. Portanto, estudos relacionados à função cardiomiócito, proliferação, apoptose e hipertrofia têm sido e continuam sendo um dos principais focos da comunidade científica. Uma vez que o coração adulto mamífero tem uma capacidade regenerativa muito limitada, com uma taxa estimada de renovação cardiomiocócica inferior a 1% ao ano, é crucialmente importante identificar de forma confiável os eventos proliferativos do cardiomiócito3,,4. A maioria das estratégias que medem eventos proliferativos dependem da coloração para análogos incorporados de nucleotídeos de DNA para avaliar a proliferação anterior ou atual, ou mancha para marcadores nucleares de proliferação ativa5. É especialmente importante identificar de forma confiável os eventos proliferativos do cardiomiócito, uma vez que o número total de cardiomiócitos proliferativos é tão baixo3,,6. Por exemplo, com base em uma taxa de renovação de 1% de cardiomiócitos endógenos por ano, pode-se esperar encontrar entre 25 e 50 cardiomócitos para ser proliferativo a qualquer momento no coração do rato adulto7,,8. Qualquer imprecisão na identificação de núcleos cardiomocícidos pode levar a resultados falsos positivos. Portanto, é fundamental identificar de forma confiável os núcleos cardiomiócitos, que se mostraram difíceis e não confiáveis das seções histológicas9. A identificação de cardiomiócitos é muito mais precisa a partir de células únicas do que de seções teciduais, pois pode ser difícil distinguir cardiomócitos de outros tipos de células, mesmo usando marcadores como α-actinina, embora o PCM1 possa ser um marcador confiável de núcleos de cardiomioce em seções histológicas10.

Os protocolos atuais dependem da isolação de cardiomiócitos vivos antes da fixação, que é conhecida por causar a morte de pelo menos 30% dos cardiomiócitos, e pode levar à seleção inadvertida de populações específicas de cardiomiócitos11. Além disso, esses protocolos são notoriamente difíceis de otimizar para fornecer resultados reprodutíveis. Mesmo técnicas de isolamento otimizadas normalmente podem produzir não mais do que 65% de cardiomiócitos vivos em forma de haste com rendimentos variados12.

Para superar essas questões, desenvolvemos um protocolo que permite aos pesquisadores isolar cardiomiócitos fixos. Como as amostras são fixadas antes do isolamento, o rendimento é maximizado, e a morfologia in vivo é bem preservada. Além disso, com este protocolo é possível isolar cardiomiócitos de amostras clínicas, que normalmente são fixadas imediatamente após a aquisição. Além disso, para identificar cardiomiócitos recém-gerados, é importante medir o estado de nucleação e ploidia dos cardiomiócitos individuais, uma vez que apenas cardiomiócitos diploides são tipicamente considerados recém-formados. A citometria de fluxo não pode distinguir a multinucleação da poliploide e é um protocolo relativamente demorado e intensivo em recursos. A delineamento manual e a medição de núcleos dentro das imagens é muito baixa e propensa ao viés humano. A quantificação automatizada de imagens de cardiomiócitos fixos e isolados manchados de DAPI resolve ambos os problemas. A determinação baseada em imagens de distribuições de nucleação e ploidia pode ser obtida com um mínimo de tempo e reagentes usando equipamentos básicos.

Protocol

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Minnesota (IACUC). 1. Preparação das soluções e equipamentos cirúrgicos Antes do isolamento, esterilize o equipamento cirúrgico utilizando 70% de solução de etanol. Adicione 2,24 g de KCl a solução salina tamponada de fosfato de 500 mL (PBS) para obter uma concentração final de 60 mM. Armazene a solução KCl-PBS à temperatura ambiente. Use 3 mL de solução KCl-PBS por mouse. Diluir 32% de solução de paraformaldeído (PFA) com PBS para obter concentração final de 4% de PFA. Prepare 10 mL de 4% pfa em PBS por mouse. A solução PFA diluída pode ser armazenada a 4 °C por 2-3 semanas em um recipiente de vidro.NOTA: A solução PFA de 4% preparada pode ser armazenada a -20 °C por períodos mais longos de tempo. Prepare 1 mL de solução de colagenase por mouse adicionando 60 mg de colagenase, tipo 2 por 1 mL de PBS. 2. Perfusão e fixação do coração Anestesiar o animal usando isoflurane de 2-5% com uma taxa de fluxo de oxigênio de 1 L/min. Confirme a anestesia confirmando a falta de movimento e menor taxa de respiração.NOTA: Injetar heparina (100-500 U/kg) antes que a eutanásia possa aumentar a qualidade e o rendimento das células, prevenindo coágulos sanguíneos, permitindo assim uma perfusão mais eficiente do coração com fixação. Eutanize o animal de acordo com metodologias aprovadas.NOTA: Seguimos as diretrizes da Associação Médica Veterinária Americana para a eutanásia de animais e obtivemos aprovação local da IACUC para eutanásia. Coloque o animal eutanizado em posição supina, e tape os membros estendidos. Corte o peito para expor o coração usando uma tesoura sem corte. Corte a aorta descendente e veia de caval inferior. Perfumar o coração injetando 3 mL de solução KCl-PBS através do ventrículo esquerdo com uma taxa de fluxo de 3 mL/min usando uma bomba peristáltica presa a um conjunto de infusão com uma agulha borboleta de 23 G (26 G para recém-nascidos). Certifique-se de não perfurar o septo.NOTA: Alternativamente, use uma agulha presa a uma seringa para injetar soluções. Perfunda o coração injetando 10 mL de solução PFA de 4% por 10 min usando uma bomba peristáltica a uma taxa de 1 mL/min. Remova todo o coração usando uma tesoura. Depois de remover o coração, é possível isolar uma região específica do coração incisando. Coloque o coração, ou um segmento dele em um tubo de microcentrifus de 1,5 mL contendo 1 mL de solução PFA de 4%. Incubar o coração no roqueiro à temperatura ambiente com velocidade de balanço entre 20-30 rpm por 1 h. 3. Isolamento de cardiomiócitos fixos Coloque o coração em uma placa de Petri contendo solução PBS. Aperte o coração para se livrar de qualquer PFA restante em ventrículos, e lave em PBS. Coloque o coração fixo em um novo tubo de microcentrifuse de 1,5 mL contendo solução de colagenase (60 mg/mL). Coloque o tubo no roqueiro (20-30 rpm) a 37 °C para incubação durante a noite.NOTA: Estenda o tempo de incubação até 1 semana e reponha a solução de colagem a cada dois dias para reduzir a possível variação de rendimento se os corações forem previstos para serem fibrosos, o que pode exigir maior tempo de digestão da colagem para digerir colágeno extracelular. Coloque a solução de colagenase e o coração em uma placa de Petri de 35 mm. Dissociar o coração em pedaços de 1 mm usando fórceps ou tesouras. Use uma pipeta de transferência para triturar ainda mais o tecido dissociado por 2 minutos. Se as partículas de tecido ainda permanecerem no prato, use uma pipeta de transferência com abertura mais estreita e continue trituração. Continue até que a maior parte do tecido seja quebrada.NOTA: A trituração sobre a trituração faz com que os cardiomiócitos individuais se quebrem. Certifique-se de não triturar demais verificando regularmente sob um microscópio. Coloque uma malha de nylon de 200-600 μm sobre a abertura do tubo de centrífuga de 15 mL.NOTA: Para cardiomiócitos hipertrofiados, recomenda-se usar 400 μm de malha de nylon em vez de 200 μm. Adicione 5 mL de PBS à placa de Petri contendo células dissociadas e filtre a solução através da malha de nylon, incluindo partículas de tecido. Lave a malha de nylon passando mais 4 ml PBS. Centrifugar a solução filtrada a 10-100 x g por 1 min.NOTA: A centrifugação de 100 x g não produzirá população de cardiomiócitos 100% pura, e algumas células não cardiomiócitos provavelmente serão incluídas. Descarte o supernaente a menos que se queira manchar/avaliar células cardíacas não cardiomiócitos também. Resuspense a pelota em 10 mL PBS antes da coloração. 4. Cardiomiócitos de coloração Colete as células por centrifugação a 100 x g por 1 min e adicione 5 mL de solução de permeabilização (por exemplo, 0,5% Triton X-100 em PBS). Incubar por 20 minutos em temperatura ambiente no roqueiro.NOTA: Para as etapas 4.1, 4.2 e 4.4 use tubos de centrífugas de 15 mL, pois é mais fácil remover o supernaente sem perturbar a pelota celular em comparação com tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL. Colete as células por centrifugação a 100 x g por 1 min, adicione 5 mL de tampão de bloqueio (por exemplo, 3% de albumina de soro bovino [BSA] na PBS) e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente em um roqueiro. Colete as células por centrifugação a 100 x g por 1 min e adicione 1 mL de solução de anticorpos primários (em PBS) com a razão de diluição apropriada. Transfira a solução para tubo de microcentrifus de 1,5 mL e incubar cardiomiócitos em solução de anticorpos primários em condições otimizadas (por exemplo, 4 °C durante a noite). Transfira cardiomiócitos com solução de anticorpos primários para um tubo centrífuga de 15 mL e adicione 9 mL de PBS. Incubar os cardiomiócitos por 10 minutos em temperatura ambiente em um roqueiro. Colete as células por centrifugação a 100 x g por 1 min e adicione 10 mL de PBS. Incubar os cardiomiócitos por 10 minutos em temperatura ambiente em um roqueiro. Repita este passo mais uma vez. Colete as células por centrifugação a 100 x g por 1 min e adicione a solução de anticorpos secundários contendo DAPI. Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente em um roqueiro, seguido de repetir o passo 4,5 duas vezes para lavar cardiomiócitos. Coloque as células em tampas ou placas compatíveis com microscópio e proceda com imagens.NOTA: As imagens incluídas no manuscrito foram tiradas com objetivos de 10x e 40x. Os lasers utilizados foram: 405 nm para DAPI, 561 nm para Alpha actinin e 640 nm para Edu. 5. Software de imagem de configuração NOTA: Siga junto com essas etapas usando o arquivo complementar 1-SoftwareScreenshots.pdf. Baixe a distribuição Fiji de ImageJ. Abra Fiji. Clique em Ajuda > Atualização… > Gerenciar sites de atualização. Verifique os sites de atualização “IJPB-plugins” e “Biomedgroup” para baixar as dependências plugins Ellipse Split e Morpholibj. Clique em Fechar. Fiji deve começar a baixar as dependências. Reinicie Fiji quando terminar. Baixe rstudio e abra-o. Copiar install.packages(c(“ggplot2”, “autothresholdr”, “dplyr”, “purrr”, “jsonlite”, “shiny”)) na linha de comando do console R e pressione a tecla Enter. Digite “y” em resposta a todas as solicitações para instalar todas as dependências R (Captura de tela 1 no Arquivo Suplementar 1). 6. Quantificação de imagem Abra Fiji e arraste “AnalyzeNucleation.py” (fornecido como um arquivo de código suplementar) na barra de status de Fiji. Isso abrirá uma janela de edição de script. Clique em Executar no canto inferior esquerdo para inilicá-lo (Captura de tela 2 no arquivo suplementar 1). Uma caixa de diálogo aparecerá(Arquivo Suplementar 1: Captura de tela 3), solicitando a localização do diretório de dados de saída. Todos os dados de análise, números e outros dados utilizados por este software serão armazenados nesta pasta. Outra caixa de diálogo maior aparecerá, exibindo todas as configurações de análise de imagem(Arquivo Suplementar 1: Captura de tela 4). Selecione o local do diretório contendo imagens a serem analisadas. Digite o formato de nome de arquivo de imagem usando expressões regulares. Digite o formato de nome de arquivo de imagem, indicando quais partes do nome do arquivo correspondem ao site de linha, coluna, canal e (opcionalmente) dentro de aparelhos, usando expressões regulares. Não coloque espaços dentro do aparelho. Surround variable parts of the filename format in braces {}. A forma como os arquivos são salvos depende do software de imagem, e esta etapa recuperará informações relevantes do nome do arquivo de imagem.NOTA: Por exemplo, a sequência de formator” Placa 1-(? P[A-Za-z]+)(? P[0-9]+)-(? P[A-Za-z]+).tif”descreve um nome de arquivo que começa com “Placa 1-“, que é seguido por uma ou mais letras alfabéticas indicando a linha, que é seguida por um ou mais dígitos indicando a coluna, que é seguida por “-“, que é seguida por uma ou mais letras indicando o canal, que é seguido por “.tif”. As letras dentro dos suportes angulares como “” são nomes variáveis e são automaticamente copiadas nos dados quando são coletadas. Um dos nomes variáveis deve ser “” Indique o nome dos canais em que a mancha nuclear é visível e onde os cardiomiócitos são visíveis. Esses nomes devem ser exatamente como estão na parte combinada com a variável “” nos nomes de arquivos de expressão regular. Indique como as imagens devem ser agrupadas usando nomes de variáveis separados por círios. Todas as imagens dentro de um determinado grupo serão abertas e analisadas em um lote. Por exemplo, se as imagens forem divididas em conjuntos para cada poço, e houver um poço para cada combinação única de linha e coluna, então escreva “linha, coluna” neste campo.NOTA: Estas variáveis de agrupamento devem ser um subconjunto das variáveis utilizadas na sequência de formato. Não use “canal” como variável de agrupamento, isso separará as imagens de canais correspondentes entre si. Indique se as imagens são ou não costuradas em uma imagem de poço ou separadas para cada site. No primeiro caso, o site não deve ser indicado na sequência de formato de nome de arquivo. Escolha qual método de limiar usar para separar núcleos do plano de fundo. Todos os métodos padrão de limiar de Fiji estão disponíveis. Teste diferentes métodos de limiar para determinar qual funciona melhor para o conjunto de imagens. Neste exemplo, escolha o método Otsu. Indicar se o limiar deve ou não ser recalculado para cada imagem do site ou se o mesmo limiar deve ser usado para cada imagem do grupo. Indique se as imagens do cardiomiócito são brightfield ou usam um marcador fluorescente. Indique o método de limiar de cardiomiócito. Se o brightfield foi escolhido na etapa anterior, este método de limiar será aplicado a imagens de campo brilhante filtradas por borda. Indicar se o limiar deve ou não ser recalculado para cada imagem do site ou se o mesmo limiar deve ser usado para cada imagem do grupo. Indique o número de linhas de imagens do site que cobrem cada poço. Indique o número de colunas de imagens do site que cobrem cada poço. Indique a área mínima dos núcleos em pixels. Use um tamanho mínimo generosamente baixo, um limiar mais alto e mais preciso será calculado na etapa de análise. Indique a área mínima de cardiomiócitos. Depois de escolher as configurações desejadas clique em OK. Imagens semelhantes às encontradas na Figura 3 e Figura 4 aparecerão na tela, mostrando os diferentes estágios do pipeline de análise. Inspecione essas imagens para garantir que o limiar e a segmentação estejam ocorrendo corretamente. A pasta de resultados selecionados deve agora ser preenchida com dados de análise(Arquivo Complementar 1: Captura de tela 5). Outros arquivos que não sejam os dados de análise podem ser salvos com segurança nesta pasta, desde que seus nomes não comecem com “cm_”, “nuclei_” ou “nucleilink_”. 7. Análise de dados NOTA: Os arquivos csv que são produzidos podem ser analisados manualmente. Cada subconjunto de imagem analisado produz um trigêmeo de arquivos csv chamados “nuclei(metadados).csv”, “nucleilink(metadados).csv” e “cardiomiócitos(metadados),csv”, onde (metadados) é substituído por uma sequência de pares de valor de nome da forma “_(nome)=(valor)”, onde (nome) e (valor) são sequências de caracteres alfanuméricos derivados de strings combinadas na expressão regular dada anteriormente. (Por exemplo, se a linha e a coluna foram indicadas nos nomes dos arquivos, então as strings como “_row=F” e “_column=8” estarão presentes). A coluna mais não nomeada de cada núcleo e arquivo nucleilink é um número de identificação do núcleo. A coluna “Min” do arquivo nucleilink é a identidade do cardiomiócito que continha o referido núcleo totalmente ou 0 de outra forma. A coluna “Max” dos núcleos é a identificação do cardiomiócito de maior numeração que continha o referido núcleo em parte, ou 0 de outra forma. A coluna “Média” do arquivo cardiomiócitos é o número de identificação de cardiomioces. Abra “AnalyzeMultinucleatedServer.R” em Rstudio (fornecido como arquivo de código suplementar). No topo deste arquivo está uma variável chamada “folderName”. Ao lado dele há um filepath. Aqui, digite o caminho para a pasta de dados de saída selecionada na última etapa, sem a barra final (Arquivo Suplementar 1: Captura de tela 6). No canto superior esquerdo da janela de edição do script deve haver um aplicativo de execuçãocom a batedia verde. Clique nesta seta. Pode levar algum tempo para os dados serem carregados e para o aplicativo aparecer. Inicialmente, três gráficos gating serão visíveis, um para indicar o limiar mínimo de área nuclear válida, um para indicar o limiar mínimo de intensidade média nuclear válido, e um para indicar o diâmetro mínimo válido máximo para cardiomiócitos. Use os controles deslizantes para definir esses limites (Arquivo Suplementar 1: Captura de tela 7).NOTA: Em cada um desses gráficos, deve-se estar presente um grande e amplo pico correspondente a núcleos válidos ou cardiomiócitos, ladeados por caudas largas representando detritos ou cardiomiócitos segmentados errôneos. Use os limiares para cortar uma cauda de cada um dos picos. Role para baixo. Clique no botão Aplicar limites selecionados (inferior do arquivo complementar 1: Captura de tela 7). Clique no botão Distribuição de intensidade do gráfico. Isso tornará o enredo da distribuição da intensidade nuclear de toda a amostra e subtramas separadas para cada variável de agrupamento.NOTA: Por exemplo, se e variáveis de agrupamento foram inseridas na expressão regular no diálogo Fiji, gráficos indicando a distribuição de intensidade por linha e por coluna aparecerão aqui(Arquivo Suplementar 1: Captura de tela 8). Se as condições de iluminação e coloração eram constantes nas diferentes partes da amostra, essas parcelas deveriam mostrar claramente dois picos de intensidade, um mais escuro, mais alto para os núcleos diploides e um mais brilhante e mais curto para os núcleos tetraploides. A variação intrasample resultará em este padrão não ser visível no gráfico de toda a amostra e há grande variedade na localização dos picos diploides e tetraploides por linha, coluna ou outra variável de agrupamento. Neste último caso, role para baixo verifique a caixa de seleção Normalizar separadamente por grupo para explicar essa variação (Arquivo Suplementar 1: Captura de tela 9). Clique no botão Calcular Ploidy (Arquivo Suplementar 1: Captura de tela 9). Clique no botão Plot Estimated Ploidy Distribution. Os gráficos aparecerão nas janelas vazias à direita. No gráfico normalizado da amostra inteira, o padrão de dois picos deve ser visível se não fosse antes. Selecione limiares para isolar os picos diploides e tetraploides entre si e os outliers usando os controles deslizantes(Arquivo Suplementar 1: Captura de tela 9). Role para baixo. Clique no botão Calcular Ploidy e Nucleação (Arquivo Suplementar 1: Captura de tela 10). Clique no botão Plot e Save Into Results Folder. O plot salvo na pasta de resultados selecionados também será exibido nesta janela interativa (Arquivo Suplementar 1: Captura de tela 10).

Representative Results

Os cardiomiócitos foram isolados de acordo com o protocolo descrito acima. Usando este método, normalmente temos cardiomiócitos uniformemente singularizados que são relativamente puros sem contaminar células não cardiomiócitos(Figura 1A). Os cardiomiócitos são facilmente identificados sob microscopia de campo brilhante devido ao seu tamanho característico e birefringência. Esta técnica é fácil de implementar e fornece resultados consistentes de diferentes isolamentos com rendimentos e qualidade de cardiomiócitos comparáveis(Figura 1B). Cardiomiócitos isolados podem ser armazenados a 4 °C por várias semanas antes de serem usados. Cardiomiócitos isolados de acordo com o protocolo acima podem ser usados para várias aplicações a jusante, como medir o tamanho do cardiomiócito, ploidy cardiomiócito e imunocitoquímica. Como resultado representativo, mostramos que os cardiomiócitos isolados de acordo com este protocolo podem ser manchados usando anticorpos e azidas conjugadas fluorocromático para a química de cliques para detectar a localização de proteínas específicas ou para detectar replicação de DNA cardiomiócito, respectivamente. Por exemplo, manchamos cardiomiócitos com anticorpos reconhecendo α-actinina para mostrar o padrão característico de coloração da linha Z de sarcomeres(Figura 2A). Em um experimento separado, administramos o analógico timmidina 5-Ethynyl-2′-deoxyuridina (EdU) em camundongos antes de isolar cardiomiócitos fixos. Após o isolamento do cardiomiócito, manchamos para a EdU incorporada utilizando os protocolos padrão13, e conseguimos detectar cardiomiócitos que haviam sido submetidos à fase S em cardiomiossetos mononucleados, binucleados e trinucleados(Figura 2B). Para ampliar ainda mais a utilidade do método de isolamento, desenvolvemos um pipeline que permite quantificação de ploidia cardiomiócito com base na coloração integrada do DNA. Para ser capaz de medir o estado ploidy de células ou núcleos, precisávamos segmentar núcleos e cardiomiócitos. A Figura 3 mostra uma representação da estratégia que usamos para identificar núcleos individuais. Primeiro, a imagem original manchada de DNA(Figura 3A)é limiar baseada na intensidade(Figura 3B). Aqui, usamos DAPI para manchar para DNA, mas qualquer outro corante nuclear que mostrasse uma correlação linear com o conteúdo do DNA funcionaria. O programa permite que qualquer um dos métodos de limiar de intensidade de Fiji seja escolhido, mas neste exemplo o método de Otsu foi usado. Máscaras nucleares que estão tocando a borda da imagem ou são menores do que o limite de área mínima de pixel especificado são excluídas. Então, as elipses são adequadas às máscaras nucleares, segmentando núcleos individuais. A Figura 3C mostra essas elipses sobrepostas na imagem original. Em seguida, os buracos são preenchidos nas máscaras, e os pixels da imagem são então divididos em territórios com base em qual elipse eles são mais proximais para(Figura 3D). As fronteiras desses territórios são então utilizadas para traçar linhas através de aglomerados nucleares, terminando o processo de segmentação nuclear (Figura 3E). O próximo passo envolve a detecção de cardiomiócitos. Para imagens de cardiomiócitos que são obtidas com base em células fluorescentes manchadas(Figura 4A),o processo é muito semelhante ao dos núcleos. A imagem é limiar com base em um valor de intensidade calculado pelo método de limiar selecionado, neste caso o método triângulo. Máscaras de cardiomiócitos identificadas que estão tocando o limite da imagem ou estão abaixo de um determinado tamanho são excluídas e os orifícios são preenchidos nas máscaras para fornecer cardiomiócitos devidamente segmentados(Figura 4B). Como os cardiomiócitos têm uma forma mais irregular do que os núcleos, nenhuma tentativa é feita para segmentar aglomerados de cardiomiócitos. Em vez disso, esses clusters são excluídos com base no seu alto diâmetro mínimo de Feret durante a etapa de análise. A segmentação de imagens de campo brilhante prossegue ligeiramente diferente. Primeiro, a imagem original de campo brilhante(Figura 4C) é processada com um filtro de borda Sobel. Este filtro calcula o valor absoluto do gradiente de cada pixel dentro da imagem. Pixels em regiões com mudanças rápidas recebem altos valores e pixels em regiões lisas da imagem recebem valores baixos. Esta imagem filtrada por borda é então limiar por intensidade, usando o método Triângulo, resultando em cardiomiócitos mascarados(Figura 4D). Essas máscaras altamente irregulares são então suavizadas e ligadas juntas através do fechamento morfológico usando um círculo com um raio de 2 pixels, que preenche todas as regiões brancas na imagem onde o círculo não pode caber sem sobrepor uma região negra(Figura 4E). Finalmente, os buracos nas máscaras são preenchidos, regiões que tocam a borda são excluídas, e pequenas partículas são removidas, terminando o processo de segmentação de cardiomiócitos(Figura 4F). Usando a estratégia de segmentação delineada, podemos então determinar o estado de nucleação dos cardiomiócitos individuais. Usando esta abordagem, determinamos o estado de nucleação de cardiomiócitos isolados de corações de camundongos CD-1 de raça elevada em pontos de tempo pós-natal precoces. Corações de camundongos recém-nascidos (primeiro dia de vida) mostraram que a maioria dos cardiomiócitos nesse ponto são mononucleados(Figura 5: neonatal). Esta alta frequência de cardiomiócitos mononucleados é muito menor em camundongos juvenis (2 semanas de idade), onde os cardiomiócitos mononucleados compõem cerca de 25% da população total de cardiomiócitos(Figura 5: juvenil). Finalmente, podemos medir o estado ploidy de núcleos individuais dentro de cardiomiócitos, e determinar se eles são diploides ou tetraploides. Esses resultados mostram maior frequência de núcleos tetraploides em camundongos adolescentes (Figura 6). Figura 1: Eficiência do isolamento do cardiomiócito após a fixação. (A) Imagem representativa de cardiomiócitos isolados manchados com DAPI para mostrar núcleos. (DAPI (azul), Brightfield (cinza)) (B) Rendimento de cardiomiócitos isolados de diferentes camundongos aos 3 meses de idade. Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Imunocitoquímica de cardiomiócitos isolados. (A) Imagem representativa de cardiomiócitos manchados para α-actinin (α-actinin (vermelho) e DAPI (azul)). (B) Cardiomiócitos manchados para EdU incorporado (vermelho) e DAPI (azul). Cardiomiócitos representativos mononucleados (esquerda), binucleado (médio) e trinucleado (direita) e EdU positivos são mostrados. Barras de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Estratégia para segmentação nuclear. (A) Imagem original do canal DAPI. (B) Imagem limiar (neste exemplo, o método de Otsu foi usado). (C) Máscaras identificadas a partir das imagens limiares sobrepostas na imagem manchada do DAPI original. (D) Tessellation voronoi baseada em máscaras nucleares. (E) Núcleos segmentados finais, com clusters divididos destacados. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Estratégia para segmentação de cardiomiócitos. (A) Troponina fluorescente original eu manchei imagem de cardiomiócito. (B) Imagem limiar de triângulo, após preencher orifícios e excluir pequenos objetos e aqueles que tocam na borda. (C) Imagem original de cardiomiócito de campo brilhante(D) Imagem de cardiomiócito filtrada e com limiar de triângulo(E) Imagem filtrada por borda após o fechamento morfológico com um raio de dois pixels(F) Mesma imagem após o preenchimento de buracos e exclusão de pequenos objetos e aqueles que tocam a borda. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Classificação de cardiomiócitos com base no número de núcleos. Os corações neonatais (1 dia de idade) contêm cardiomiócitos mais mononucleados do que os corações juvenis (14 dias de idade). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Distribuição do conteúdo de DNA cardiomiócito por núcleo. Nos recém-nascidos (esquerda), 13,5% dos núcleos cm mononucleados são tetraploides e 11,9% dos núcleos cm binucleados são tetraploides. Em juvenis (à direita), 33,9% dos núcleos cm mononucleados são tetraploides e 31,2% dos núcleos cm binucleados são tetraploides. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Arquivo complementar 1: Capturas de tela de software. Clique aqui para ver este arquivo (clique com o botão direito do mouse para baixar). Arquivo complementar 2: AnalyzeNucleation.py. Clique aqui para ver este arquivo (clique com o botão direito do mouse para baixar). Arquivo suplementar 3: AnalyzeMMUltinucleatedServer.R. Clique aqui para ver este arquivo (clique com o botão direito do mouse para baixar).

Discussion

Uma vez que os cardiomiócitos não podem ser mantidos na cultura, é importante isolar os cardiomiócitos primários para poder estudar sua arquitetura e função11. Assim, as técnicas de isolamento do cardiomiócito têm sido amplamente utilizadas no campo cardíaco. Se o objetivo é determinar aspectos funcionais dos cardiomiócitos, é importante isolar cardiomiócitos viáveis. Estes cardiomiócitos vivos também podem ser usados para realizar imunossuagem em cardiomiócitos isolados. No entanto, otimizar a técnica de isolar cardiomiócitos vivos é tecnicamente desafiador, e mesmo as melhores técnicas normalmente só produzem cardiomiócitos em forma de vara viva de 60-65%, e os cardiomiócitos restantes são todos emparedados e morrendo ou mortos11,12. Aqui, desenvolvemos uma técnica que permitirá aos pesquisadores primeiro corrigir o coração e, em seguida, isolar cardiomiócitos eficientemente. Este novo protocolo permite rendimentos muito maiores de cardiomiócitos em forma de vara em comparação com protocolos publicados anteriormente. Além disso, desenvolvemos uma plataforma de análise de imagem para categorizar cardiomiócitos automaticamente com base na nucleação e ploidia. Com essas novas metodologias, os grupos podem manchar cardiomiócitos para diferentes proteínas, e estudar ploidy cardiomiocócito e status de nucleação como substitutos para o potencial regenerativo do coração.

O protocolo descrito aqui é relativamente simples, e pode ser realizado sem qualquer equipamento avançado. A quantidade de colagem e tempo de incubação para digestão pode variar dependendo do lote de colagem, e da empresa que o fornece. Utilizamos colagenase tipo 2, uma vez que este é mais amplamente utilizado para digerir o coração para a obtenção de cardiomiócitos vivos. Com base em nossas observações, determinamos que a incubação noturna com colagenase tipo 2 de 60 mg/mL é ótima para quase todos os corações do rato, independentemente do nível de fibrose. Nunca tivemos um problema de superdigestão, pois as proteínas intracelulares são fixas e não tão acessíveis quanto o colágeno extracelular. No entanto, se o coração não for digerido corretamente, pode ser necessária uma trituração mais vigorosa, o que causa fragmentação celular devido ao estresse da tesoura. Assim, é crucial garantir que o coração seja digerido corretamente antes de passar para a trituração. A rigidez do coração pode ser testada apertando com fórceps para avaliar o grau de digestão. Após a incubação com colagemnase, os corações devem ser menos rígidos e fáceis de rasgar. Outros tipos de colagemnase também podem ser usados. Um relatório anterior usou uma combinação de colagens B e D14.

Além disso, acreditamos que este protocolo pode ser usado para avaliar o número total de cardiomiócitos no coração15. No entanto, se o objetivo é obter e quantificar todos os cardiomiócitos do coração, é importante incubar os corações por longos períodos de tempo na solução de colagenase (por exemplo, 3-7 dias), onde a solução de colagemnase deve ser reabastecida uma vez por dia. Isso minimizará as inconsistências na eficiência do isolamento, eliminando o impacto do grau de trituração no rendimento do cardiomiócito.

O uso de conteúdo de DNA para medir a ploidia não é novo, e tem sido usado na citometria de fluxo por décadas. Recentemente, foi demonstrado que a microscopia pode ser usada da mesma forma para estimar o conteúdo de DNA por núcleo16. Aqui, implementamos essa estratégia para medir a ploidy dos núcleos cardiomiócitos, como substituto de cardiomiócitos recém-formados. O dogma no campo da regeneração cardíaca é que apenas cardiomiócitos imípidos e implóides podem sofrer citocinas e dar origem a novos cardiomiócitos. Uma vez que é muito desafiador medir a nova formação de cardiomiócitos in vivo, isolando cardiomiocócitos que foram perseguidos após a administração de um analógico nucleotídeo de DNA e determinando o nível de cardiomiocrócitos mononucleados e diploides tem sido usado como uma aproximação da capacidade do coração de gerar novos cardiomiócitos17. Aqui, fornecemos uma macro para ImageJ que permite a fácil quantificação da ploidia cardiomiócito. No mínimo, 500 núcleos devem ser medidos para atingir uma estimativa precisa da localização do pico do G1. Se for necessário ter cuidado para garantir que as condições de coloração e imagem sejam consistentes em todos os poços da placa imagem, apenas 500 núcleos em toda a amostra precisam ser imagens, caso contrário, é necessário haver 500 núcleos por grupo de imagem18,,19. Limitações da medição baseada em imagem de nucleação e ploidia incluem dificuldade para distinguir núcleos de células aderentes dos núcleos de cardiomiócitos reais, ao usar imagens bidimensionais. Tais células aderentes podem resultar em superestimação da quantidade de células multinucleadas e diminuir a precisão das medidas da população do núcleo cardiomiocócito tetraploide. Uma possível estratégia para resolver esse problema seria usar o marcador nuclear cardiomiócito PCM16,20. No entanto, tivemos dificuldades para obter uma coloração PCM1 confiável em células ou tecidos devidamente fixados.

Outra limitação potencial é que algumas imagens de manchas nucleares podem ter uma coloração citoplasmática de fundo significativa, impedindo o limiar adequado usando os métodos construídos por Fiji sem um pré-processamento extensivo. Além disso, a contribuição irregular dessa fluorescência de fundo em estimativas ploidy reduz sua precisão. Além disso, se as células não forem deixadas na solução de coloração de DNA por tempo suficiente, o corante fluorescente não se ligará à saturação dentro dos núcleos e a suposição de uma relação linear entre intensidade nuclear integrada e conteúdo de DNA não será mais precisa.

Deve-se notar que o software não pode segmentar clusters de cardiomiócitos e, em vez disso, removê-los da análise. Portanto, é extremamente importante para os cardiomiócitos de sementes com uma densidade relativamente baixa (por exemplo, 1000 células/cm2). Além disso, o software não pode distinguir entre dois cardiomiócitos alinhados de ponta a ponta e cardiomiócitos longos e singulares. Esses tipos de aglomerados podem inflar erroneamente as estimativas de multinucleação.

Embora o método descrito não permita a obtenção de cardiomiócitos viáveis e, portanto, não possa ser utilizado para medir processos celulares dinâmicos, se o objetivo é realizar imunossuagem, acreditamos que o método descrito é superior aos protocolos existentes com maiores rendimentos de cardiomiócitos e melhor qualidade em termos de morfologia e localização de proteínas. Finalmente, o método descrito poderia ser usado para isolar cardiomiócitos de amostras clínicas14,21. Acreditamos que a metodologia descrita pode ajudar diferentes pesquisadores a obter cardiomiócitos de alta qualidade e medir a nucleação e a ploidia como substitutos para a nova formação de cardiomiócitos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O JHvB é apoiado por doações do NIH, Medicina Regenerativa Minnesota, e um Prêmio individual de Pesquisa Biomédica da Fundação Hartwell.

Materials

96 wells plate for imaging Corning 3340 We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging
Alpha actinin Novus Biologicals NBP1-32462 This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres
Blunt scissors Fine Scissor Tools 14072-10 We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart
C57BL/6J The Jackson Laboratory 664 Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population
CD-1 mice Charles river 22 Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population
Collagenase 2 Worthington LS004177 For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation
Copper (II) sulfate pentahydrate Sigma-Aldrich 203165-10G For edu staining
Cy5 Picolyl Azide Click Chemistry Tools 1177-25 Azide used for edu staining
Cytation3 BioTek – Used for automated imaging for DNA analysis
DAPI Life Technologies D3571 DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water.
donkey anti-mouse IgG-Alexa568 Life Technologies A10037 Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes
Forceps ROBOZ RS-5137 We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144212 To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5
ImageJ imagej.net/Fiji/Downloads – Used for analyzing images
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich 255564-100G For edu staining
Needle for infusion TERUMO SV*23BLK We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection
Nikon A1R HD25 Nikon – Used to take confocal images of alpha actinin staining
Nylon mesh 200 micron Elko filtering 03-200/54 Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied)
Nylon mesh 400 micron Elko filtering 06-400/38 Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes
Phosphate Buffered Saline (1X) Corning 21-040-CV This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it
Potassium chloride, Granular Mallinckrodt 6858 Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature
R r-project.org – Used for data analysis of the measurements obtained from images
Tris Base Fisher Scientific BP152-5 Used to buffer EdU staining reaction
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References

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CardiomyocytesIsolationImmunocytochemistryPloidy AnalysisFixed HeartsPerfusionCollagenaseDissociationFiltrationCentrifugation

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Yücel, D., Solinsky, J., van Berlo, J. H. Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis. J. Vis. Exp. (164), e60938, doi:10.3791/60938 (2020).
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