عزل القلب من القلب الثابتة للكيمياء المناعية وتحليل بلودي
Summary
الهدف من هذا العمل هو تطوير طريقة لعزل عضلة القلب بشكل مستنسخ من القلب البالغ وقياس محتوى الحمض النووي والنية.
Abstract
يتكون قلب الثدييات البالغ من أنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك خلايا القلب والخلايا البطانية والضوباء الليفية. نظرًا لأنه من الصعب تحديد نواة من الخلايا القلبية القلبية بشكل موثوق في أقسام النسيج ، تعتمد العديد من المجموعات على عزل الخلايا القلبية القابلة للحياة قبل التثبيت لأداء المناعة. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنيات الحية عزل cardiomyocyte الأمثل لتحقيق أقصى قدر من العائد ، ومقومات البقاء وجودة العينات ، مع التقلبات المتأصلة من عينة إلى عينة على الرغم من أقصى الأمثل. هنا، ونحن تقرير بروتوكول استنساخها، التي تنطوي على تثبيت قبل الهضم الأنزيمي للقلب، مما يؤدي إلى أقصى عائد مع الحفاظ على مورفولوجيا في الجسم الحي من cardiomyocytes الفردية. لقد طورنا منصة تحليل آلية لتحديد عدد محتويات النوى والحمض النووي لكل نواة لـ cardiomyocytes الفردية. بعد فضح تجويف الصدر، تم القبض على القلب في دياستول عن طريق الضخ مع 60 م ك. ك. في برنامج تلفزيوني. بعد ذلك ، تم إصلاح القلب في محلول 4٪ شبهformaldehyde (PFA) ، ثم هضمه بمحلول كولاجين 60 ملغم /مليلتر. بعد الهضم، تم تفرد الخلايا عن طريق التثاب، وتم إثراء جزء القلب من خلال الطرد المركزي التفاضلي. كانت تلطخت أمراض القلب المعزولة لتروبونين تي α actinin لتقييم نقاء السكان الذين تم الحصول عليها. وعلاوة على ذلك، قمنا بتطوير منصة تحليل الصور لتحديد نواة القلب و ploidy حالة بعد تلطيخ DAPI. أدت التقييمات غير القابلة لل لتصوير النتائج إلى نتائج متسقة وقابلة للتكرار. وهكذا، مع هذا البروتوكول، فمن الممكن للحفاظ على مورفولوجيا أصلية من أمراض القلب الفردية للسماح للكيمياء المناعية وتحليل محتوى الحمض النووي مع تحقيق أقصى عائد.
Introduction
وقد أمراض القلب السبب الرئيسي للوفاة في معظم الدول الغربية لعقود عديدة1,2. على الرغم من أن العديد من التحسينات في علاج أمراض القلب والأوعية الدموية قد تحسنت البقاء على قيد الحياة, لا توجد حاليا أي علاجات يمكن أن تحل محل فقدان عضلة القلب. لذلك، كانت الدراسات المتعلقة بوظيفة cardiomyocyte، والانتشار، و المبرمج المبرمج والتضخم ولا تزال محور التركيز الرئيسي للمجتمع العلمي. منذ قلب الثدييات الكبار لديه قدرة تجديدية محدودة جدا، مع معدل تجديد القلب القلبية المقدرة من أقل من 1٪ سنويا، فمن المهم للغاية لتحديد موثوق الأحداث تكاثرية cardiomyocyte3،4. معظم الاستراتيجيات التي تقيس الأحداث الانتشارية تعتمد إما على تلطيخ التناسخ النووي المدمجة الحمض النووي لتقييم الانتشار السابق أو الحالي، أو وصمة عار للعلامات النووية للانتشار النشط5. من المهم بشكل خاص تحديد موثوق الأحداث التكاثرية cardiomyocyte منذ العدد الإجمالي للقلب التكاثري منخفض جدا3،6. على سبيل المثال ، استنادا إلى معدل تجديد 1 ٪ من القلب الذاتية في السنة ، يمكن للمرء أن يتوقع أن تجد بين 25 و 50 cardiomyocytes أن تكون تكاثرية في أي وقت من الأوقات في قلب الماوس الكبار7،8. قد تؤدي أي أخطاء في تحديد نواة القلب العضلي إلى نتائج إيجابية خاطئة. ولذلك، فمن الأهمية بمكان لتحديد موثوق نيوية cardiomyocyte، والتي ثبت أنها صعبة وغير موثوق بها من أقسام النسيج9. تحديد عضلة القلب هو أكثر دقة بكثير من الخلايا المفردة من أقسام الأنسجة كما أنه قد يكون من الصعب التمييز بين cardiomyocytes من أنواع الخلايا الأخرى حتى عند استخدام علامات مثل α-actinin، على الرغم من PCM1 قد يكون علامة موثوق بها من نيات cardiomyocyte في أقسام الأنسجة10.
تعتمد البروتوكولات الحالية على عزل الخلايا القلبية الحية قبل التثبيت ، والتي من المعروف أنها تسبب وفاة ما لا يقل عن 30٪ من الخلايا القلبية القلبية ، وقد تؤدي إلى اختيار غير مقصود لفئات محددة من الخلايا القلبيةالقلبية 11. وعلاوة على ذلك، فإن من المعروف أن من الصعب تحسين هذه البروتوكولات من أجل توفير نتائج قابلة للاستنساخ. حتى تقنيات العزل الأمثل يمكن أن تنتج عادة ما لا يزيد عن 65٪ حية، وقضبان على شكل cardiomyocytes مع غلة متفاوتة12.
للتغلب على هذه القضايا، وضعنا بروتوكولًا يسمح للباحثين بعزل عضلة القلب الثابتة. منذ يتم إصلاح العينات قبل العزل، يتم تعظيم العائد، ويتم الحفاظ على مورفولوجيا الجسم الحي بشكل جيد. وعلاوة على ذلك، مع هذا البروتوكول من الممكن لعزل cardiomyocytes من العينات السريرية، والتي عادة ما تكون ثابتة مباشرة بعد الشراء. وعلاوة على ذلك, لتحديد cardiomyocytes ولدت حديثا, من المهم لقياس nucleation والوضع ploidy من cardiomyocytes الفردية, منذ فقط يُفترض أن تكون قد تشكلت حديثاً. لا يمكن أن يميز قياس تدفق الشقوق بين تعدد النوى والبوليبلويد وهو بروتوكول طويل الوقت والموارد بشكل نسبي. إن تحديد وقياس النوى في الصور هو منخفض جداً وعرضة للتحيز البشري. الكم الآلي لصور ثابتة، معزولة DAPI الملون cardiomyocytes يحل كل من هذه المشاكل. ويمكن الحصول على تحديد التصوير القائم على النوى وتوزيعات غير مُنْحَة مع حد أدنى من الوقت والكواشف باستخدام المعدات الأساسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
منذ لا يمكن الحفاظ على cardiomyocytes في الثقافة، من المهم عزل القلبية الأولية لتكون قادرة على دراسة الهندسة المعمارية الخاصة بهم وظيفة11. وبالتالي، تم استخدام تقنيات عزل القلب العضلي على نطاق واسع في مجال القلب. إذا كان الهدف هو تحديد الجوانب الوظيفية للقلب العضلي، فمن المهم عزل cardiomyocytes قابلة للحياة. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه القلبية الحية لأداء المثبطات المناعية على الخلايا القلبية المعزولة. ومع ذلك ، فإن تحسين تقنية عزل القلب الحية أمر صعب تقنيًا ، وحتى أفضل التقنيات عادة ما تؤدي فقط إلى 60-65٪ من القلب على شكل قضيب ، ويتم ثني القلب المتبقية ويموتون أو موتى11،12. هنا، طورنا تقنية من شأنها أن تسمح للباحثين لإصلاح القلب أولا، ومن ثم عزل عضلة القلب بكفاءة. يسمح هذا البروتوكول الجديد لعوائد أعلى بكثير من القلب على شكل قضيب مقارنة بالبروتوكولات المنشورة سابقا. وعلاوة على ذلك، قمنا بتطوير منصة تحليل التصوير لتصنيف cardiomyocytes تلقائيا على أساس nucleation و ploidy. مع هذه المنهجيات الجديدة، يمكن للمجموعات وصمة عار cardiomyocytes للبروتينات المختلفة، ودراسة القلبية من ploidy و nucleation الوضع كبديل للإمكانات التجديدية للقلب.
البروتوكول الموصوف هنا واضح نسبياً، ويمكن تنفيذه بدون أي معدات متطورة. قد تختلف كمية الكولاجين وحضانة الوقت لعملية الهضم اعتمادا على الكثير collagenase، والشركة التي توفر ذلك. استخدمنا الكولاجين من النوع 2، لأن هذا هو الأكثر استخداما لهضم القلب للحصول على القلب الحية. استنادا إلى ملاحظاتنا، قررنا أن الحضانة بين عشية وضحاها مع 60 ملغ/مل الكولاجين نوع 2 هو الأمثل لقلوب الماوس تقريبا جميع بغض النظر عن مستوى التليف. لم يكن لدينا مشكلة عسر الهضم الزائد كما يتم إصلاح البروتينات داخل الخلايا وليس في متناول الكولاجين خارج الخلية. ومع ذلك، إذا لم يتم هضم القلب بشكل صحيح، قد تكون هناك حاجة إلى التثاب أكثر قوة، مما يسبب تفتيت الخلايا بسبب الإجهاد القص. وبالتالي ، من المهم التأكد من أن القلب هضم بشكل صحيح قبل الانتقال إلى التثاقب. يمكن اختبار صلابة القلب عن طريق الضغط باستخدام ملقط لتقييم درجة الهضم. بعد الحضانة مع الكولاجيناز، وينبغي أن تكون قلوب أقل صلابة وسهلة لتمزيق. ويمكن أيضا أن أنواع أخرى من collagenase يمكن استخدامها. استخدم تقرير سابق مزيجًا من الكولاجين B و D14.
وعلاوة على ذلك، نعتقد أن هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتقييم العدد الإجمالي للقلب العضلي في القلب15. ومع ذلك، إذا كان الهدف هو الحصول على وقياس جميع cardiomyocytes من القلب، فمن المهم لاحتضان قلوب لفترات طويلة من الزمن في حل الكولاجيناز (على سبيل المثال، 3-7 أيام)، حيث ينبغي تجديد حل الكولاجيناز مرة واحدة في اليوم. وهذا سوف يقلل من التناقضات في كفاءة العزل من خلال القضاء على تأثير درجة التثاقل على العائد cardiomyocyte.
استخدام محتوى الحمض النووي لقياس ploidy ليست جديدة، وقد استخدمت في عملية استئصال الدراجات منذ عقود. في الآونة الأخيرة ، تبين أن المجهر يمكن أن تستخدم بالمثل لتقدير محتوى الحمض النووي لكل نواة16. هنا، قمنا بتنفيذ هذه الاستراتيجية لقياس ploidy من نواة القلب، كبديل ل cardiomyocytes شكلت حديثا. العقيدة في مجال تجديد القلب هو أن أحادية النواة فقط، يمكن أن تخضع خلايا القلب ثنائي الخلايا السيتوكينية و تؤدي إلى ظهور خلايا القلب الجديدة. منذ أنه من الصعب جدا لقياس تكوين cardiomyocyte جديدة في الجسم الحي، وعزل cardiomyocytes التي تمت مطاردتها بعد إدارة التناظرية نوكليوتيد الحمض النووي وتحديد مستوى أحادية النواة، وقد استخدمت cardiomyocytes مُنَقَدَة كتكياس لقدرة القلب على توليد القلب الجديد17. هنا ، نحن نقدم ماكرو لـ ImageJ يسمح بالكمية السهلة لـ cardiomyocyte ploidy. ويجب، كحد أدنى، قياس 500 نوات لتحقيق تقدير دقيق لموقع قمة مجموعة الـ 1. إذا تم توخي الحذر لضمان أن ظروف التلطيخ والتصوير متناسقة عبر كل بئر من لوحة imaged ، فقط 500 نواة عبر العينة بأكملها تحتاج إلى صورة ، وإلا ، هناك حاجة إلى أن تكون 500 نواة لكل مجموعة الصورة18،19. وتشمل القيود على القياس القائم على التصوير للنيوية و ploidy صعوبة في التمييز بين النوى من الخلايا المضمّنة من نوى القلب العضلي الضمّي الفعلي، عند استخدام صور ثنائية الأبعاد. قد تؤدي هذه الخلايا الملتصقة إلى المبالغة في تقدير كمية الخلايا متعددة النوى وتقلل من دقة قياسات نواة عضلة القلب رباعية النخاع. استراتيجية واحدة ممكنة لحل هذه المشكلة سيكون لاستخدام علامة cardiomyocyte النووية PCM16،20. ومع ذلك، فقد واجهتنا صعوبات للحصول على PCM1 موثوق بها تلطيخ على الخلايا أو الأنسجة ثابتة بشكل صحيح.
وثمة قيد محتمل آخر هو أن بعض صور البقع النووية قد يكون لها تلطيخ سيتوبلازمي خلفية كبيرة، مما يحول دون العتبة المناسبة باستخدام أساليب فيجي المبنية دون معالجة مسبقة واسعة النطاق. وبالإضافة إلى ذلك، فإن المساهمة غير المنتظمة لهذه الخلفية fluorescence في تقديرات ploidy يقلل من دقتها. وعلاوة على ذلك، إذا لم تترك الخلايا في محلول تلوين الحمض النووي لفترة كافية، فإن الصبغة الفلورية لن ترتبط بالتشبع داخل النوى ولن يكون افتراض وجود علاقة خطية بين الكثافة النووية المتكاملة ومحتوى الحمض النووي دقيقاً بعد الآن.
وتجدر الإشارة إلى أن البرنامج لا يمكن تقسيم مجموعات cardiomyocyte وبدلا من ذلك إزالتها من التحليل. ولذلك، من المهم للغاية أن تُزرع خلايا القلب ذات الكثافة المنخفضة نسبياً (على سبيل المثال، 1000 خلية/سم2). علاوة على ذلك ، لا يمكن للبرنامج التمييز بين جهازي cardiomyocytes اصطف من نهاية إلى نهاية وطويلة ، وdydmyocytes المفرد. وقد تؤدي هذه الأنواع من التجمعات إلى تضخيم تقديرات تعدد النيات خطأ.
على الرغم من أن الطريقة الموصوفة لا تسمح بالحصول على خلايا القلب القابلة للتطبيق وبالتالي لا يمكن استخدامها لقياس العمليات الخلوية الديناميكية ، إذا كان الهدف هو إجراء مناعة ، نعتقد أن الطريقة الموصوفة متفوقة على البروتوكولات الحالية مع غلة أعلى من خلايا القلب وجودة أفضل من حيث المورفولوجيا وتوطين البروتين. وأخيرا، يمكن استخدام الطريقة الموصوفة لعزل الخلايا القلبية القلبية من العينات السريرية14،21. ونحن نعتقد أن المنهجية المذكورة يمكن أن تساعد الباحثين مختلفة للحصول على عالية الجودة cardiomyocytes وقياس نوات و ploidy كبديل لتشكيل cardiomyocyte جديدة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم JHvB من المنح من المعاهد القومية للصحة، الطب التجديدي مينيسوتا، وجائزة البحوث الطبية الحيوية الفردية من مؤسسة هارتويل.
Materials
| 96 wells plate for imaging | Corning | 3340 | We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging |
| Alpha actinin | Novus Biologicals | NBP1-32462 | This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres |
| Blunt scissors | Fine Scissor Tools | 14072-10 | We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
| CD-1 mice | Charles river | 22 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
| Collagenase 2 | Worthington | LS004177 | For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165-10G | For edu staining |
| Cy5 Picolyl Azide | Click Chemistry Tools | 1177-25 | Azide used for edu staining |
| Cytation3 | BioTek | – | Used for automated imaging for DNA analysis |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water. |
| donkey anti-mouse IgG-Alexa568 | Life Technologies | A10037 | Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes |
| Forceps | ROBOZ | RS-5137 | We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144212 | To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5 |
| ImageJ | imagej.net/Fiji/Downloads | – | Used for analyzing images |
| L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 255564-100G | For edu staining |
| Needle for infusion | TERUMO | SV*23BLK | We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection |
| Nikon A1R HD25 | Nikon | – | Used to take confocal images of alpha actinin staining |
| Nylon mesh 200 micron | Elko filtering | 03-200/54 | Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied) |
| Nylon mesh 400 micron | Elko filtering | 06-400/38 | Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21-040-CV | This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it |
| Potassium chloride, Granular | Mallinckrodt | 6858 | Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature |
| R | r-project.org | – | Used for data analysis of the measurements obtained from images |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | Used to buffer EdU staining reaction |
References
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135 (10), e146 (2017).
- Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the future of cardiovascular disease in the United States: a policy statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (8), 933-944 (2011).
- Eschenhagen, T., et al. Cardiomyocyte Regeneration: A Consensus Statement. Circulation. 136 (7), 680-686 (2017).
- Tzahor, E., Poss, K. D. Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart. Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).
- Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
- Richardson, G. D. Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
- Bergmann, O., et al. Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover. Experimental Cell Research. 317 (2), 188-194 (2011).
- O’Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Shaklee, J., et al. Development of a Click-Chemistry Reagent Compatible with Mass Cytometry. Scientific Reports. 8 (1), 6657 (2018).
- Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
- Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).
- Patterson, M., et al. Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration. Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).
- Gomes, C. J., Harman, M. W., Centuori, S. M., Wolgemuth, C. W., Martinez, J. D. Measuring DNA content in live cells by fluorescence microscopy. Cell Division. 13, 6 (2018).
- Woo, L. A., et al. High-content phenotypic assay for proliferation of human iPSC-derived cardiomyocytes identifies L-type calcium channels as targets. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 204-214 (2018).
- Morikawa, Y., Heallen, T., Leach, J., Xiao, Y., Martin, J. F. Dystrophin-glycoprotein complex sequesters Yap to inhibit cardiomyocyte proliferation. Nature. 547 (7662), 227-231 (2017).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
