Montaje dirigido de proteínas similares a la elastina en estructuras supramoleculares definidas y encapsulación de carga in Vitro
Summary
En la interfaz de disolventes orgánicos y acuosos, las proteínas anfifílicas a medida similares a la elastina se ensamblan en estructuras supramoleculares complejas como vesículas, fibras y coacervados desencadenados por parámetros ambientales. Los protocolos de montaje descritos producen compartimentos basados en membranas de proteínas (PMBC) con propiedades ajustables, lo que permite la encapsulación de varias cargas.
Abstract
Los bloques de construcción proteígicos a medida son candidatos versátiles para el montaje de estructuras supramoleculares como células mínimas, vehículos de administración de medicamentos y andamios enzimáticos. Debido a su biocompatibilidad y atún a nivel genético, las proteínas similares a la elastina (ELP) son bloques de construcción ideales para aplicaciones biotecnológicas y biomédicas. Sin embargo, el montaje de estructuras supramoleculares basadas en proteínas con propiedades fisioquímicas distintas y un buen potencial de encapsulación sigue siendo un reto.
Aquí proporcionamos dos protocolos eficientes para el autoensamblaje guiado de ELP anfifílicos en arquitecturas de proteínas supramoleculares como coacervados esféricos, fibras y vesículas estables. Los protocolos de montaje presentados generan compartimentos basados en membranas proteicas (PMBC) basados en ELP con propiedades fisicoquímicas adaptables. Los PBPC demuestran el comportamiento de separación de fases y revelan la fusión de membranadependiente del método y son capaces de encapsular moléculas de carga fluorescente químicamente diversas. Los PMBC resultantes tienen un alto potencial de aplicación como plataforma de formulación y entrega de medicamentos, célula artificial y espacio de reacción compartimentado.
Introduction
El montaje de estructuras supramoleculares para aplicaciones biotecnológicas es cada vez más importante1,2,3,4,5. Para el montaje de arquitecturas funcionales como coacervados, vesículas y fibras con las propiedades fisicoquímicas deseadas es importante comprender y controlar las propiedades fisicoquímicas y conformacionales de los componentes. Debido a la precisión molecular de las moléculas que se encuentran en la naturaleza, los bloques de construcción para las estructuras supramoleculares se basan cada vez más en lípidos, ácidos nucleicos o proteínas. En comparación con los polímeros sintéticos, los bloques de construcción proteíricos permiten un control preciso sobre las estructuras supramoleculares emergentes6 a nivel genético. La secuencia de aminoácidos primarios (aa) de los bloques de construcción de proteínas individuales codifica intrínsecamente la información para su potencial de ensamblaje desde el nivel molecular hasta el nivel macroscópico, así como la forma tridimensional y las propiedades físicas de la estructura supramolecular final7.
Los métodos reportados para el montaje de diferentes estructuras supramoleculares a menudo involucran proteínas anfifílicas como proteínas sensibles a la elastina sensibles a la temperatura (ELP)5,8,9, oleosina recombinante10y anfifes de proteínas artificiales11. Los métodos activados por temperatura han llevado al montaje de micelas4,10,12Fibras13Hojas14y vesículas9,15,16. Se han aplicado métodos de disolventes orgánicos para la formación de vesículas dinámicas a base de proteínas8,11,14. Hasta ahora, los protocolos aplicados para la formación de vesículas a menudo carecen de control de montaje sobre los conjuntos de tamaño de los micrómetros16,17o tienen un rendimiento de montaje limitado5. Además, algunas vesículas basadas en ELP informaron han deteriorado el potencial de encapsulación12o estabilidad limitada en el tiempo9. Abordando estos inconvenientes, los protocolos presentados permiten el autoensamblaje de estructuras supramoleculares de tamaño de micrómetro y sucrómetro con propiedades fisioquímicas distintas, buen potencial de encapsulación y estabilidad de largo plazo. Los ELP anfifílicos a medida se ensamblan en estructuras supramoleculares, abarcando el rango de coacervados esféricos y paquetes de fibra retorcida altamente ordenados hasta vesículas unilamelares dependiendo del protocolo aplicado y las condiciones ambientales asociadas. Los grandes compartimentos basados en membranas de proteínas vesiculares (PMBC) revelan todos los fenotipos principales, como la fusión por membrana y el comportamiento de separación de fase análogo a los liposomas. Los PMBC encapsulan eficientemente moléculas de carga fluorescente químicamente diversas que se pueden monitorear mediante microscopía de epifluorescencia simple. Los dominios ELP repetitivos utilizados en este estudio son bloques de construcción atractivos para arquitecturas supramoleculares basadas en proteínas18. La unidad de repetición de pentapéptido el ELP (VPGVG) es conocida por tolerar diferentes aa además de prolina en la cuarta posición (valina, V), preservando sus propiedades estructurales y funcionales19. El diseño de ELP anfifílicos que contienen dominios hidrófilos e hidrófobos distintivos se realizó insertando residuos de invitados aa (X) en la repetición VPGXG con hidrofobicidad, polaridad y carga distintas20. Dominios el ELP anfifílicos donde está equipado con fenilalanina hidrófoba (F) o isoleucina (I) mientras que el dominio hidrófilo contenía ácido glutámico cargado (E) o arginina (R) como residuos de invitado. Una lista de construcciones elP anfifílicas elegibles y las correspondientes secuencias aa se puede encontrar en la información suplementaria y referencias8,21. Todos los bloques de construcción están equipados con pequeños tintes fluorescentes o proteínas fluorescentes para su visualización mediante microscopía de fluorescencia. mEGFP y otras proteínas fluorescentes se fusionaron n terminalmente a los dominios hidrófilos de los anfifílicos ELP. Los colorantes orgánicos se conjugaron a través de una cepa libre de cobre promovida por la cicloadición alquino-azida (SPAAC) a un aminoácido no natural (UAA) introducido co-traduccionalmente. La incorporación co-traduccional de la UAApara-azidofenilalanina (pAzF)22permite la modificación N-terminal del dominio ELP hidrófilo. De esta manera el tinte fluorescente verde BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) o cualquier molécula fluorescente pequeña con un ciclooctino tenso se puede utilizar como sonda fluorescente. La incorporación exitosa del uAA pAzF y la cicloadición del tinte a través de SPAAC se puede confirmar fácilmente a través de LC-MS/MS debido a la ionización eficiente de los péptidos trippticos correspondientes8. Este pequeño tinte orgánico se aplicó para ampliar la opción de disolvente para los protocolos de montaje, ya que las proteínas fluorescentes son incompatibles con la mayoría de los disolventes orgánicos. A continuación se describen los dos protocolos de montaje más eficientes para estructuras supramoleculares desarrolladas en nuestro laboratorio. El método de hinchazón THF sólo es compatible con el ELP anfifílico modificado con tinte orgánico. Por el contrario, el método de extrusión de 1 butanol (BuOH) es compatible con muchas proteínas como sonda fluorescente, por ejemplo, mEGFP, ya que el método descrito preserva completamente la fluorescencia de estas proteínas de fusión. Además, la encapsulación de moléculas pequeñas y el comportamiento de fusión vesicular funcionan mejor empleando el método de extrusión BuOH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un fallo al seguir los protocolos descritos para el montaje de estructuras supramoleculares definidas conduce principalmente a la formación de agregados inespecíficos(Figura 2,IV) o a anfifílicos ELP distribuidos homogéneos. Los pasos críticos del protocolo se discuten a continuación:
Para un alto rendimiento de expresión del ELP anfifílico, una temperatura relativamente baja de 20oC es óptima. Para una purificación exitosa basada en la afinidad de la EL…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al BMBF el apoyo financiero y al Centro de Análisis de Sistemas Biológicos (ZBSA) por proporcionar el centro de investigación. Estamos agradecidos a P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, California, EE. UU. por proporcionar el plásmido pEVOL-pAzF. Agradecemos al personal del Centro de Imágenes de Vida (LIC) en el Centro de Análisis de Sistemas Biológicos (ZBSA) de la Universidad Albert-Ludwigs-Universidad freiburgpor su ayuda con sus recursos de microscopía confocal, y el excelente apoyo en la grabación de imágenes.
Materials
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
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