エブラスチン様タンパク質の定義された上膜構造とカーゴカプセル化への組み立て
Summary
有機溶媒および水性溶媒の界面では、カスタマイズされた両親媒性エラスチン様タンパク質は、環境パラメータによって引き起こされる小胞、繊維、コアセルベートなどの複雑な上分子構造に組み立てられます。記載された組立プロトコルは、調整可能な特性を有するタンパク質膜ベースのコンパートメント(PMBC)を生成し、様々な貨物のカプセル化を可能にする。
Abstract
テーラードプロフェナスビルディングブロックは、最小細胞、薬物送達車、酵素足場などの上分子構造の組み立てのための汎用性の高い候補です。遺伝子レベルでの生体適合性とタンナビリティにより、エラスチン様タンパク質(ELP)は、バイオテクノロジーおよびバイオメディカルアプリケーションに理想的なビルディングブロックです。それにもかかわらず、異なる物理化学的特性と良好なカプセル化の可能性を有するタンパク質ベースの上分子構造の組み立ては依然として困難である。
ここでは、球状コアセルベート、繊維、安定した小胞などの上分子タンパク質アーキテクチャへの両親媒性ELPの誘導自己集合のための2つの効率的なプロトコルを提供します。提示されたアセンブリプロトコルは適応可能な物理化学的特性を有するELPに基づいてタンパク質膜ベースのコンパートメント(PMBCs)を生成する。PMBCは、相分離挙動を実証し、方法依存性膜融合を明らかにし、化学的に多様な蛍光カルゴ分子をカプセル化することができます。得られたPMBCは、薬剤製剤および送達プラットフォーム、人工細胞、および区画化反応空間として高い応用可能性を有する。
Introduction
バイオテクノロジーアプリケーションのための上分子構造の組み立ては、1、2、3、4、52,3,4,5ますます重要になってきています。コアセルベート、小胞、所望の物理化学的特性を有する繊維などの機能アーキテクチャの組み立てには、成分の物理化学的および立体構造特性を理解し、制御することが重要です。自然界に見られる分子の分子精度により、上分子構造のビルディングブロックは、脂質、核酸、タンパク質に基づいています。合成ポリマーと比較して、タンパク質性ビルディングブロックは、遺伝的レベルでの創発的な超分子構造6を正確に制御することを可能にする。個々のタンパク質構築ブロックの一次アミノ酸(aa)配列は、分子から巨視的レベルまでの組み立てポテンシャルの情報、ならびに最終的な上層分子構造7の3次元形状および物性に関する情報を本質的にコードする。
異なる上分子構造の組み立てのための報告された方法は、多くの場合、温度感受性エラスチン様タンパク質(ELP)などの両親媒性タンパク質を含む5,8,9、組換えオレオジン10人工タンパク質両親媒性体11.温度トリガ方法は、ミセルの組み立てにつながっています4,10,12繊維13シート14と小胞9,15,16.有機溶媒を含む方法は、動的タンパク質ベースの小胞の形成に適用されている8,11,14.これまでのところ、小胞形成のための適用されたプロトコルは、多くの場合、マイクロメーターサイズのアセンブリに対するアセンブリ制御を欠く16,17またはアセンブリの収量が限られている5.さらに、報告されたELPベースの小胞の中には、カプセル化の可能性が損なわれている12または時間の経過に応じ安定性が制限される9.これらの欠点に対処するために、提示されたプロトコルは、異なる物理化学的特性、良好なカプセル化電位および長期安定性を有するマイクロメータおよびサブマイクロメータサイズの超分子構造の自己集合を可能にする。合わせた両親媒性ELPは、球状のコアセルベートや高度に順序付けられたねじれた繊維束から、適用されたプロトコルおよび関連する環境条件に応じてユニラメラ小胞まで、幅広い範囲に及ぶ上層分子構造に組み立てられます。大型のベシキュラータンパク質膜ベースコンパートメント(PMBC)は、リポソームに類似した膜融合および相分離挙動などの主要な表現型をすべて明らかにします。PMBCは、化学的に多様な蛍光カルゴ分子を効率的にカプセル化し、単純な蛍光顕微鏡で監視することができます。この研究で使用される反復ELPドメインは、タンパク質ベースの上分子アーキテクチャの魅力的なビルディングブロックです18.ELPペンタペプチド反復ユニット(VPGVG)は、その構造的および機能的特性を維持しながら、4番目の位置(valine,V)でプロリン以外の異なるaaを許容することが知られている19.独特の親水性および疎水性ドメインを含む両親媒性ELPの設計は、明確な疎水性、極性、および電荷を伴うVPGXG反復にaaゲスト残基(X)を挿入することによって実現された20.疎水性フェニルアラニン(F)またはイソロイシン(I)を備えた両親媒性ELPドメインは、一方で、親水性ドメインにはゲスト残基としてグルタミン酸(E)またはアルギニン(R)を含んでいた。適格な両親媒性ELP構造および対応するaa配列のリストは、補足情報および参照に記載されています。8,21.蛍光顕微鏡による可視化用に、小さな蛍光色素または蛍光タンパク質のいずれかを装備したすべてのビルディングブロック。mEGFPと他の蛍光タンパク質を、ELP両親媒性の親水性ドメインにN末端に融合した。有機色素は、非天然アミノ酸(UAA)を同時導入したアルキン-アジドシクロ付加(SPAAC)を促進した銅フリー株を介して共役した。UAAの共同翻訳の組み込みpara-アジドフェニルアラニン (pAzF)22親水性ELPドメインのN末端修飾を可能にする。このように緑色蛍光色素BDP-FL-PEG4-DBCO(BDP)または、シクロオクティンが緊張した任意の小さな蛍光分子を蛍光プローブとして使用することができます。UAA pAzFの組み込みとSPAAC経由の色素のサイクロ付加は、対応するトリプティックペプチドの効率的なイオン化により、LC-MS/MSを介して容易に確認することができます8.蛍光タンパク質はほとんどの有機溶媒と相容れないため、この小さな有機色素は、組立プロトコルの溶媒選択を広げるために適用されました。当社の研究室で開発された上分子構造の2つの最も効率的な組立プロトコルを以下に説明します。THFの膨潤法は有機染料修飾された両親媒性ELPとのみ適合する。これに対して、1-ブスタノール(BuOH)押出方法は、例えばmEGFPのような蛍光プローブとして多くのタンパク質と互換性があるが、記載された方法はこれらの融合タンパク質の蛍光を完全に保存するからである。さらに、BuOH押出法を採用することで、小分子および小分子のカプセル化と小胞融合挙動が最適です。
Protocol
Representative Results
Discussion
定義された上層分子構造の組み立てに関する記載されたプロトコルに従う間の障害は、主に非特異的な凝集体(図2、IV)の形成または均質に分散したELP-両親球体のいずれかにつながる。プロトコルの重要な手順について、以下で説明します。
両親媒性ELPの発現量が高い場合は、20°Cの比較的低温が最適です。両親媒性ELPの親和性に基づく精製に成功す…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、BMBFの財政支援と、研究施設を提供してくれた生物システム分析センター(ZBSA)に感謝する。プラスミドpEVOL-pAzFを提供してくれたP.G.シュルツ、TSRI、ラホヤ、カリフォルニア州、アメリカに感謝しています。アルバート・ルートヴィヒス大学フライブルク生物システム分析センター(ZBSA)のライフイメージングセンター(LIC)のスタッフの共焦点顕微鏡資源、画像記録の優れたサポートに感謝します。
Materials
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
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