בימוי האסיפה של אלסטין כמו חלבונים לתוך הגדרת מבנים Supraולקולריים מוגדרים מחוץ לגופית
Summary
בממשק של ממיסים אורגניים ומימית, מותאם המותאם לאלסטין וחלבונים בעלי מבנה מולקולרי מורכבים כגון שלפוחיות, סיבים ומדבקות מופעלות על ידי פרמטרים סביבתיים. פרוטוקולי ההרכבה המתוארים מניבים תאים מבוססי חלבון ממברנה (PMBCs) עם מאפיינים שניתן לסמוך עליהם, המאפשרים כימוס של מטענים שונים.
Abstract
אבני בניין מותאמות פרוטטינואאוס הם מועמדים מגוונים עבור הרכבה של מבנים supraמולקולריים כגון תאים מינימליים, כלי רכב של משלוחי סמים והאנזים פיגומים. עקב תאימות תאימות שלהם על הרמה הגנטית, החלבונים כמו אלסטין (למשל) הם אבני בניין אידיאלי עבור יישומים ביו טכנולוגיים ביו-רפואיים. אף על פי כן, ההרכבה של מבנים supraמולקולריים מבוססי חלבון עם תכונות פיזיוכימיות ברורים ופוטנציאל מעטפת טוב נשאר מאתגר.
כאן אנו מספקים שני פרוטוקולים יעילים עבור הרכבה עצמית מודרך של elps אמפיפילי לתוך ארכיטקטורות חלבון סופרא מולקולרית כגון כדורי כדורית, סיבים ושלפוחיות יציבה. פרוטוקולי ההרכבה שהוצגו ליצור תאים מבוססי חלבון ממברנה (PMBCs) מבוסס על ELPs עם תכונות הסתגלות פיסיוכימיקלים. PMBCs להפגין התנהגות הפרדת הפאזה וחשיפת שיטת היתוך ממברנה תלוי ומסוגלים לכמסים מגוון כימית מולקולות מטענים פלורסנט. PMBCs וכתוצאה מכך יש פוטנציאל יישום גבוה כמו ניסוח התרופה ופלטפורמת המסירה, תא מלאכותי, וחלל התגובה מידור.
Introduction
הרכבת של מבנים supraמולקולריים ליישומים ביוטכנולוגיים הופכת להיות חשובה יותר ויותר1,2,3,4,5. עבור ההרכבה של ארכיטקטורות פונקציונלי כגון מאכאוטים, ושלפוחיות, וסיבים עם תכונות פיסיוכימיקלים הרצוי חשוב להבין ולשלוט על המאפיינים הפיזיקליים והקונפורמציה של הרכיבים. בשל הדיוק המולקולרי של מולקולות שנמצאו בטבע, אבני בניין עבור מבנים supraמולקולריים מבוססים יותר ויותר על שומנים, חומצות גרעין או חלבונים. לעומת פולימרים סינתטיים, אבני הבניין פרוטטינואאוס לאפשר שליטה מדויקת על מבנה סופרא מולקולרית מתהווה6 ברמה הגנטית. החומצה האמינית העיקרית (aa) הרצף של אבני בניין חלבון בודדים מקודד את המידע עבור פוטנציאל ההרכבה שלהם מן המולקולרי עד רמת מאקרוסקופי, כמו גם את הצורה תלת מימדי ותכונות פיזיות של מבנה סופרא מולקולרית הסופי7.
שיטות מדווחות להרכבת מבנים מולקולריים שונים מעורבות לעתים קרובות בחלבונים מסוג שונות, כגון אלסטין עם חלבונים רגישים בטמפרטורה.מיכל 5,8,9, רקומביננטי oleosin10ומטבעוניים של חלבון מלאכותי11. הטמפרטורות שגרמו לשיטות הובילו להרכבת מיקרולים4,10,12, סיבים13, סדינים14ושלפוחיות9,15,16. שיטות הכוללות ממיסים אורגניים הוחלו על היווצרות חלבון דינאמי מבוסס שלפוחיות8,11,14. עד כה, פרוטוקולים שהוחלו עבור היווצרות שלפוחית לעיתים קרובות חסרים בקרת הרכבה על הרכבות בגודל מיקרומטר16,17או שיהיה ברשותך תפוקת הרכבה מוגבלתמיכל 5. בנוסף, יש המדווחים על מספר שלפוחיות של המבוסס על היכולת לפגום בפוטנציאל12או יציבות מוגבלת לאורך זמן9. הטיפול בחסרונות אלה, הפרוטוקולים המוצגים מאפשרים הרכבה עצמית של מבני מיקרומטר ומיקרומטר מולקולרי בגודל תת-מיקרומטר עם תכונות פיזיוכימיות ברורים, פוטנציאל מעטיפת טוב ויציבות זמן רב. מותאם במיוחד להרכיב מבנים מולקולריים, המשתרעים על-ידי מגוון כדורי וחבילות סיבים מעוותים לunilamellar שלפוחיות בהתאם לפרוטוקול המוחל ולתנאי הסביבה הקשורים. חלבון וממברנה גדול מבוססי קרום התאים (PMBC) לחשוף את כל פנוטיפים הראשי כגון פיוז’ן ממברנה התנהגות הפרדת פאזה אנלוגית ליפוזומים. PMBCs מכמס ביעילות מולקולות מטענים פלורסנט מגוונת אשר ניתן לפקח באמצעות מיקרוסקופ epiפלואורסצנטי פשוט. הדומיינים החוזרים ונשנים בשימוש במחקר זה הם אבני בניין אטרקטיבי עבור ארכיטקטורות מבוססות חלבון סופרא מולקולרית18. יחידת החזרה הפנטדית של סיוע (vpgvg) ידועה לסבול aa שונה מלבד פרולין בעמדה הרביעית (valine, V), תוך שמירה על מאפיינים מבניים ופונקציונלי19. העיצוב של ELPs אמפיפילי המכיל תחומים הידרופיפילית והידרופובי ייחודיים התממשו על ידי החדרת שאריות האורחים aa (X) ב VPGXG חזרה עם הידרופוטטי ברורים, קוטביות, טעינה20. בתחומים שונים של הידרופובי (F) או איזולאוצין (I) בעוד התחום ההידרופילי הכיל גלוטמית חומצה (E) או ארגינין (R) כפסולת אורחים. ניתן למצוא רשימה של בנייה מתאימה של מבנים למען הילד ורצפי ה-aa במידע המשלים והפניות8,21. כל אבני הבניין שבו מצוידים או עם צבעי פלורסנט קטנים או חלבונים פלורסנט עבור ויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופ ניאון. מגה-בוקס וחלבונים פלורסנט אחרים היו N-סופני התמזגו לתחומים הידרופילי של האמפיפינרס. הצבעים האורגניים היו מצוענים באמצעות מאמץ לקדם את הנחושת, לאחר שהוא הציג את חומצת האמינו הטבעית (UAA). התאגדות השיתוף המשותף של ה-UAApara-azidophenאלצין22מתיר את השינוי של מסוף N. של התחום ההידרופילי בדרך זו צבע פלורסנט ירוק BDP-FL-יתד4-DBCO (BDP) או כל מולקולה פלורסנט קטנה עם cyclooctyne מתוח יכול לשמש לווין פלורסנט. התאגדות מוצלחת של ה-UAA פזגז ו ציקלותוספת של הצבע באמצעות ספאץ ניתן לאשר בקלות באמצעות LC-MS/MS בשל אינון יעיל של פפטידים טריפטיים המקביל8. צבע אורגני קטן זה הוחל כדי להרחיב את בחירת הממס עבור פרוטוקולי ההרכבה, מאז חלבונים פלורסנט אינם תואמים את רוב המיסים האורגניים. שני פרוטוקולי ההרכבה היעילים ביותר עבור מבנים מולקולריים שפותחו במעבדה שלנו מתוארים להלן. שיטת הנפיחות THF תואם רק עם צבע אורגני שונה למען הטוב ביותר. לעומת זאת, 1-butanol (BuOH) שיטת ההבלטה תואמת חלבונים רבים כמו בדיקה פלורסנט לדוגמה mEGFP, מאז השיטה המתוארת משמר באופן מלא את הזריחה של אלה חלבונים היתוך. בנוסף, כימוס של מולקולות קטנות התנהגות היתוך vesicular עובד הטוב ביותר על ידי שימוש בשיטת BuOH שחול.
Protocol
Representative Results
Discussion
תקלה בזמן השימוש בפרוטוקולים המתוארים להרכבת מבנים מולקולריים מוגדרים, מובילה בעיקר להיווצרות אגרגטים לא ספציפיים (איור 2, IV) או להפצת הומוגנרים. שלבים קריטיים של הפרוטוקול נדונים להלן:
בעבור התשואה הגבוהה של המידע האמפיבי, טמפרטורה נמוכה יחסית של 20 ° c היא א…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים ל-BMBF לתמיכה פיננסית ולמרכז לניתוח מערכות ביולוגיות (מרכז המחקר) למתן מתקן מחקרי. אנו אסירי תודה לפ. ג. שולץ, TSRI, לה הויה, קליפורניה, ארה ב לאספקת הפלפמיד pEVOL-פזף. אנו מודים לצוות של מרכז הדמיה לייף (LIC) במרכז לניתוח מערכות ביולוגיות (Ludwigs SA) של ה אלברט-, אוניברסיטת פרייבורג לעזרה עם משאבי המיקרוסקופיה שלהם, ותמיכה מצוינת בהקלטת תמונה.
Materials
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
- Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
- Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins. Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).
- Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).
- Dreher, M. R., et al. Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- Matsuurua, K. Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures. RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).
- Rocklin, G. J., et al. Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing. Science. 357 (6347), 168-175 (2017).
- Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library. Small. 15 (30), 1900163 (2019).
- Jang, Y., Hsieh, M. -. C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity. Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).
- Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).
- Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly. Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).
- Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium. Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).
- Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).
- Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).
- Park, W. M., Champion, J. A. Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Vogele, K., et al. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. Journal of Visualized Experiments. (148), e59831 (2019).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials. Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).
- Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions. Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).
- Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Sonnino, S., Prinetti, A. Membrane domains and the “lipid raft” concept. Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).
- Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. Organische Azide – explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse. Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).
- Li, Z., et al. Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT). The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).
- Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions. ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).
- Raghunathan, G., et al. A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).
- Sallach, R. E., et al. Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking. Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).
