توجيه تجميع البروتينات الشبيهة بالإيلاستين إلى هياكل فوق جزيئية محددة وتغليف البضائع في المختبر
Summary
في واجهة المذيبات العضوية والمائية ، تتجمع البروتينات الشبيهة بالإيلاستين المصممة خصيصًا في هياكل فوق جزيئية معقدة مثل الحويصلات والألياف والكواسيرفات التي تسببها المعلمات البيئية. تنتج بروتوكولات التجميع الموصوفة مقصورات تعتمد على الأغشية البروتينية (PMBCs) مع خصائص قابلة للسحب ، مما يتيح تغليف البضائع المختلفة.
Abstract
لبنات بناء البروتين مصممة هي المرشحين تنوعا لتجميع الهياكل فوق الجزيئية مثل الخلايا الحد الأدنى، ومركبات تسليم الأدوية وسقالات الإنزيمات. نظرًا لتوافقها البيولوجي وقابليتها للتآلف على المستوى الوراثي ، تعد البروتينات الشبيهة بالإيلاستين (ELP) لبنات بناء مثالية لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية والطب الحيوي. ومع ذلك، فإن تجميع الهياكل فوق الجزيئية القائمة على البروتين مع خصائص physiochemical متميزة وإمكانات تغليف جيدة لا يزال تحديا.
هنا نقدم بروتوكولين فعالين للتجميع الذاتي الموجه من ELPs amphiphilic في بنيات البروتين فوق الجزيئيمثل coacervates الكروية والألياف والحويصل المستقرة. تقوم بروتوكولات التجميع المقدمة بإنشاء مقصورات قائمة على غشاء البروتين (PMBCs) استنادًا إلى ELPs ذات خصائص فيزيائية كيميائية قابلة للتكيف. PMBCs إظهار سلوك فصل المرحلة وتكشف عن طريقة الانصهار الغشاء تعتمد وقادرة على تغليف جزيئات البضائع الفلورية المتنوعة كيميائيا. تتمتع شركات PMBCs الناتجة عن ذلك بإمكانية تطبيق عالية كمنصة لصياغة الأدوية وتسليمها، والخلية الاصطناعية، ومساحة التفاعل المجزأة.
Introduction
تجميع الهياكل فوق الجزيئية لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية أصبحت مهمة بشكل متزايد1،2،3،4،5. لتجميع العمارات الوظيفية مثل الكوات، الحويصلات، والألياف مع الخصائص الفيزيائية الكيميائية المطلوبة من المهم فهم والسيطرة على الخصائص الفيزيائية الكيميائية والتوافق للمكونات. بسبب الدقة الجزيئية للجزيئات الموجودة في الطبيعة ، تعتمد كتل البناء للهياكل فوق الجزيئية بشكل متزايد على الدهون أو الأحماض النووية أو البروتينات. بالمقارنة مع البوليمرات الاصطناعية، تسمح كتل البناء البروتينية بالتحكم الدقيق في الهياكل فوق الجزيئية الناشئة6 على المستوى الوراثي. يقوم تسلسل الأحماض الأمينية الأولية (aa) لكتل بناء البروتين الفردية بترميز المعلومات لإمكانات تجميعها من الجزيئية حتى المستوى العياني بالإضافة إلى الشكل ثلاثي الأبعاد والخصائص الفيزيائية للهيكل فوق الجزيئي النهائي7.
الطرق المبلغ عنها لتجميع الهياكل فوق الجزيئية المختلفة غالبا ما تنطوي على البروتينات الأمفيلية مثل البروتينات الحساسة لدرجة الحرارة الإيلاستين (ELP)5,8,9، المؤتلف oleosin10والبروتين الاصطناعي الأمفيلي11. وقد أدت أساليب درجة الحرارة التي أطلقت إلى تجميع micelles4,10,12الالياف13اوراق14والحويصلات9,15,16. تم تطبيق طرق تتضمن المذيبات العضوية لتشكيل الحويصلات الديناميكية القائمة على البروتين8,11,14. حتى الآن ، والبروتوكولات المطبقة لتشكيل الحويصلات غالبا ما تفتقر إلى السيطرة على التجميعات micrometer الحجم16,17أو يكون لها عائد تجميع محدود5. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بعض الحويصلات القائمة على ELP المبلغ عنها قد أضعفت إمكانات التغليف12أو استقرار محدود مع مرور الوقت9. معالجة هذه العيوب، والبروتوكولات المقدمة تمكين التجميع الذاتي للميكرومتر والصغرى الفرعية الحجم الهياكل فوق الجزيئية مع خصائص physiochemical متميزة، وإمكانات تغليف جيدة والاستقرار لفترة طويلة. تجمع ELPs الأمفيلية المصممة خصيصًا في هياكل فوق جزيئية ، تمتد عبر النطاق من الكوات كروية وحزم الألياف الملتوية عالية الطلب إلى الحويصلات unilamellar اعتمادًا على البروتوكول المطبق والظروف البيئية المرتبطة به. تكشف المقصورات الكبيرة المستندة إلى غشاء البروتين البطيني (PMBC) عن جميع الأنماط الظاهرية الرئيسية مثل دمج الأغشية وسلوك فصل المرحلة المشابه للدهون. تقوم شركات PMBCs بتغليف جزيئات الشحن الفلورية المتنوعة كيميائياً والتي يمكن رصدها باستخدام المجهر البسيط للكشف عن الفلورسينس. تعد نطاقات ELP المتكررة المستخدمة في هذه الدراسة لبنات بناء جذابة للبنيات فوق الجزيئية القائمة على البروتين18. ومن المعروف أن وحدة تكرار الببتيدات ELP (VPGVG) تتسامح مع aa مختلفة إلى جانب proline في المركز الرابع (valine, V)، مع الحفاظ على خصائصها الهيكلية والوظيفية19. تم تحقيق تصميم ELPs الأمفيلية التي تحتوي على مجالات مائية ومائية مميزة عن طريق إدراج بقايا ضيف Aa (X) في VPGXG يكرر مع الهيدروكوبية المتميزة والقطبية والشحن20. نطاقات AMPhiphilic ELP حيث مجهزة فينيل ألانين (F) أو isoleucine (I) في حين أن المجال الهيدروفيلي يحتوي على حمض الغلوتاميك المشحون (E) أو أرجينين (R) كمخلفات ضيف. يمكن العثور على قائمة ببنيات ELP الأمفيفيلية المؤهلة وتسلسل aa المقابل لها في المعلومات والمراجع التكميلية8,21. جميع اللبنات حيث مجهزة إما مع الأصباغ الفلورية الصغيرة أو البروتينات الفلورية للتصور عن طريق المجهر الفلوري. mEGFP وغيرها من البروتينات الفلورية كانت ن تنصهر ميؤوس منها إلى المجالات المائية من amphiphiles ELP . وقد تترافق الأصباغ العضوية عبر سلالة خالية من النحاس تعزيز الكين-الأزيد cycloaddition (SPAAC) إلى حمض أميني غير طبيعي تم عرضه مترجماً للمشترك (UAA). المشاركة في الترجمة لـ UAApara-azidophenylalanine (pAzF)22يسمح تعديل N-المحطة الطرفية للمجال ELP المائية. وبهذه الطريقة صبغ الفلورسنت الأخضر BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) أو أي جزيء الفلورسنت الصغيرة مع سيكلووكتاين المتوترة يمكن استخدامها كمسبار الفلورسنت. يمكن بسهولة تأكيد النجاح في دمج pAzF UAA وcycloaddition من الصبغة عبر SPAAC عن طريق LC-MS / MS بسبب التهيئة الفعالة للببتيدات التربكية المقابلة8. تم تطبيق هذه الصبغة العضوية الصغيرة لتوسيع نطاق اختيار المذيبات لبروتوكولات التجميع ، نظرًا لأن البروتينات الفلورية لا تتوافق مع معظم المذيبات العضوية. يتم وصف بروتوكولي التجميع الأكثر كفاءة للهياكل فوق الجزيئية التي تم تطويرها في مختبرنا أدناه. طريقة تورم THF متوافقة فقط مع الصبغة العضوية المعدلة AMPhiphilic ELP. في المقابل ، فإن طريقة قذف 1-butanol (BuOH) متوافقة مع العديد من البروتينات مثل مسبار الفلورسنت على سبيل المثال mEGFP ، لأن الطريقة الموصوفة تحافظ بشكل كامل على فلورسسينس من هذه البروتينات الاندماجية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تغليف الجزيئات الصغيرة وسلوك الانصهار الفيزلي يعمل بشكل أفضل من خلال استخدام طريقة البثق BuOH.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطأ أثناء اتباع البروتوكولات الموصوفة لتجميع الهياكل فوق الجزيئية المحددة يؤدي بشكل رئيسي إما إلى تشكيل مجاميع غير محددة(الشكل 2، IV) أو إلى AMPhiphiles ELP-amphiphiles الموزعة بشكل متجانس. وترد أدناه مناقشة الخطوات الحاسمة للبروتوكول:
لعائد التعبير العالي من ELP amphiphilic، ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون بنك دبي للموارد المالية على الدعم المالي ومركز تحليل النظم البيولوجية (ZBSA) لتوفيره مرفق البحث. ونحن ممتنون لP. G. شولتز، TSRI، لا جولا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية لتوفير pEVOL-pAzF plasmid. نشكر موظفي مركز تصوير الحياة (LIC) في مركز تحليل الأنظمة البيولوجية (ZBSA) التابع لجامعة ألبرت لودفيغز-فريبورغ على المساعدة في مواردهم من الفحص المجهري المحوري، والدعم الممتاز في تسجيل الصور.
Materials
| 1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
| 1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
| 1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
| 2log DNA ladder | NEB | ||
| 2-Mercaptoethanol | Roth | ||
| 50 mL Falcon tubes | VWR | ||
| 79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
| Acetic acid glacial | VWR | ||
| Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
| Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
| BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
| Biofuge | Heraeus | ||
| Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
| Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
| BspQI | NEB | ||
| Camera DS Qi1 | Nikon | ||
| Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
| CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
| Chloramphenicol | Roth | ||
| CompactStar CS 4 | VWR | ||
| Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
| Digital sonifier | Branson | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
| Dnase I | Applichem | ||
| EarI | NEB | ||
| EcoRI-HF | NEB | ||
| Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
| Ethanol absolute | Roth | ||
| Ethidium bromide solution | Roth | ||
| Filter supports | Avanti | ||
| Glass plates | Bio-Rad | ||
| Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
| Glycin | Applichem | ||
| H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
| Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
| HindIII | NEB | ||
| HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
| Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
| Illuminator ix 20 | INTAS | ||
| Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
| Imidazole | Merck | ||
| Immersions oil for microscopy | Merck | ||
| Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
| Inkubator 1000 | Heidolph | ||
| IPTG, >99% | Roth | ||
| Kanamycinsulfate | Roth | ||
| L(+)-Arabinose | Roth | ||
| Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
| LB-Medium | Roth | ||
| Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
| Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
| Microscope CM 100 | Philips | ||
| Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
| Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
| Microscopy slides | VWR | ||
| Microwave | Studio | ||
| Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
| NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
| Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
| Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
| Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
| PH meter 766 calimatic | Knick | ||
| Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
| PowerPac basic | BioRad | ||
| Propanol-2-ol | Emplura | ||
| Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
| Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
| Reinforcement rings | Herma | ||
| SacI HF | NEB | ||
| SDS Pellets | Roth | ||
| Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
| Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
| T4 DNA Ligase | NEB | ||
| TEMED | Roth | ||
| TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
| Thermomix comfort | Eppendorf | ||
| THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
| Triton X 100 | Roth | ||
| Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
| Ultrasonic cleaner | VWR | ||
| Urea p.a. | Roth | ||
| Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
| XbaI | NEB | ||
| XhoI | NEB | ||
| ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
References
- Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
- Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins. Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).
- Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).
- Dreher, M. R., et al. Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
- Matsuurua, K. Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures. RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).
- Rocklin, G. J., et al. Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing. Science. 357 (6347), 168-175 (2017).
- Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library. Small. 15 (30), 1900163 (2019).
- Jang, Y., Hsieh, M. -. C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity. Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).
- Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).
- Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly. Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).
- Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium. Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).
- Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).
- Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).
- Park, W. M., Champion, J. A. Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).
- Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862 (2018).
- Vogele, K., et al. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. Journal of Visualized Experiments. (148), e59831 (2019).
- Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).
- Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
- Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials. Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).
- Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions. Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).
- Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
- Sonnino, S., Prinetti, A. Membrane domains and the “lipid raft” concept. Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).
- Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. Organische Azide – explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse. Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).
- Li, Z., et al. Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT). The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).
- Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions. ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).
- Raghunathan, G., et al. A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).
- Sallach, R. E., et al. Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking. Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).
