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Chemistry

Attacco covalente di singole molecole per la spettroscopia della forza basata su AFM

Published: March 16, 2020
doi:
10.3791/60934
, , , ,
1Institute of Physical Chemistry,Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, 2Chair in Polymer Chemistry,Saarland University, 3Cluster of Excellence livMatS at FIT – Freiburg Center for Interactive Materials and Bioinspired Technologies,University of Freiburg

Summary

L’attaccamento covalente delle molecole della sonda alle punte a sbalzo a forza atomica (AFM) è una tecnica essenziale per lo studio delle loro proprietà fisiche. Questo ci permette di determinare la forza di stiramento, la forza di desorption e la lunghezza dei polimeri tramite la spettroscopia a forza singola a singola molecola basata su AFM con elevata riproducibilità.

Abstract

La spettroscopia a forza atomica a forza singola di forza (AFM) è uno strumento ideale per studiare le interazioni tra un singolo polimero e le superfici. Per un vero esperimento a singola molecola, l’attaccamento covalente della molecola sonda è essenziale perché solo allora si possono ottenere centinaia di tracce di estensione della forza con una stessa singola molecola. Molte tracce sono a loro volta necessarie per dimostrare che una singola molecola è sonda. Inoltre, la passività è fondamentale per prevenire le interazioni indesiderate tra la singola molecola sonda e la punta a sbalzo AFM, nonché tra la punta a sbalzo AFM e la superficie sottostante. Il protocollo di funzionalizzazione qui presentato è affidabile e può essere facilmente applicato a una varietà di polimeri. Nelle tracce di estensione della forza vengono rilevati eventi caratteristici di singola molecola (ad esempio, tratti e altipiani). Da questi eventi, è possibile ottenere parametri fisici come la forza di stiramento, la forza di desorption e la lunghezza della desorption. Ciò è particolarmente importante per l’indagine precisa di sistemi che rispondono agli stimoli a livello di singola molecola. Come sistemi esemplari poli(etilene glicole) (PEG), poli(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) e polistirolo (PS) sono allungati e desorbed da SiOx (per PEG e PNiPAM) e da superfici auto-assemblate idrofobiche (per PS) in un ambiente acquoso.

Introduction

Dalla sua invenzione negli anni ’801,il microscopio a forza atomica (AFM) è diventato una delle più importanti tecniche di imaging nella scienza naturale con risoluzione spaziale sub-nanometrica, risoluzione della forza sub-piconewton e la possibilità di misurare in vari solventi e condizioni di temperatura2,3,4,5,6,7.

Oltre all’imaging8,9, AFM viene utilizzato per eseguire la spettroscopia a forza singola molecola (SMFS) dando una visione delle interazioni adesive tra un singolo polimero e superfici, le proprietà fisiche di singoli polimeri e i meccanismi di spiegatura delle proteine7,10,11,12,13,14,15,16. In un normale esperimento SMFS, la punta a sbalzo funzionalizzata viene messa in contatto con una superficie in modo che il polimero della punta a sbalzo AFM sia presente in questa superficie. Retraendo la punta a sbalzo AFM dalla superficie, un cambiamento nella deviazione del cantilever AFM viene convertito in una forza che porta ad una curva di estensione della forza4. Parametri fisici come la forza di stiramento, la forza di desorption e la lunghezza desorption possono essere determinati come dipendenti da diversi parametri come la velocità di trazione, il tempo di svenimento sulla superficie, la profondità di indentazione nella superficie, la temperatura, il solvente17,18 e superfici diverse come substrati solidi, pellicole polimeriche o bipisti lipidi supportati19,,20,21,,22. Inoltre, un polimero può essere sondato in diverse direzioni spaziali, esaminando così le proprietà attrito del polimero23,24,25,26.

Un attaccamento covalente del polimero studiato a una punta a sbalzo AFM è essenziale per tali studi. Così, un alto rendimento di eventi di singola molecola con uno stesso polimero legato a una punta a sbalzo AFM impedisce qualsiasi distorsione dei risultati dovuta alla calibrazione della costante di molla del cantilever AFM27,28, attaccando i punti29 o diversi polimeri (con diverse lunghezze di contorno) come nel caso di esperimenti di nanopesca30,31,32. Inoltre, le interazioni con altri polimeri e gli effetti di media possono essere ampiamente prevenuti18,28. Per l’attaccamento covalente di un polimero alla punta a sbalzo AFM, possono essere applicati diversi tipi di modifiche chimiche, molte delle quali sono riassunte nel libro da Hermanson33. La chimica del collegamento a ammine e thiol-based e la chimica dei clic rappresentano i metodi più comunemente utilizzati nella funzionalizzazione della punta a sbalzo AFM34,35,36,37,38,39,40,41,42. Becke et al.40 mostrano come utilizzare 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)/NHS chimica per attaccare una proteina a una punta a sbalzo AFM. Tuttavia, i suddetti gruppi funzionali tendono a incrociare, portando così a una perdita di funzionalità43,44. Inoltre, i carbodidimidi mostrano una tendenza all’idrolisi veloce nella soluzione43. I gruppi di maleimide e tiol sono generalmente più stabili e non mostrano reazioni trasversali. Il protocollo presentato è un’ottimizzazione dei protocolli precedentemente pubblicati indicati nei riferimenti35,39.

Qui, viene presentato un protocollo di funzionalizzazione affidabile che può essere facilmente regolato per un gran numero di polimeri diversi, indipendentemente da proprietà come la lunghezza del contorno o l’idrofobicità. Sono stati scelti tre diversi polimeri a titolo di esempio: glicole ifilarfilo ifilarfilo (PEG) e poli(N-isopropilcrylacrylamide) (PNiPAM) e polistirolo idrofobico di massa molare ad alta massa molare (PS). Al fine di fornire una capacità di legame covalente con una molecola del linker appropriata, i tre polimeri sono stati selezionati per la presenza di una moiety thiol telechelica come gruppo finale funzionale. La molecola del linker stesso è in genere un polimero PEG corto con due siti attivi, un gruppo silano ad un’estremità e un gruppo di maleimide all’altra estremità. Il primo consente un attaccamento covalente alla punta a sbalzo AFM e il secondo una reazione vincolante con il gruppo tiolo del polimero di alta massa molare funzionalizzato. Inoltre, le molecole del linker PEG inattive fungono da strato passivo per prevenire interazioni indesiderate tra il polimero della sonda e la punta a sbalzo AFM, nonché tra la punta a sbalzo AFM e la superficie sottostante.

Protocol

NOTA: vedere la figura 1 per una panoramica schematica. 1. Configurazione del reagente NOTA: I polimeri utilizzati per questo protocollo sono: maleimide-polietilene glicol-triethoxysilane (silane-PEG-mal, 5 kDa), thiol-polyetilene glicol-thiol (HS-PEG-SH, 35 kDa), thiol terminato poli(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM-SH, 637 kDa) e tiol terminato polistirolo (PS-SH, 1,3 mDa). Preparare la massa ben definita e alta molare PNiPAM-SH tramite atomo trasferimento polimerizzazione radicale, seguita da conversione e riduzione del gruppo finale funzionale per l’introduzione di un thiol moiety, come descritto nella letteratura18. Vedere Figura 1 per le strutture dettagliate. Per la conservazione delle sostanze chimiche, preparare le sostanze aliquote più piccole all’interno di un sistema di scatola a guanti asciutti con atmosfera di azoto per evitare l’esposizione all’ossigeno atmosferico e all’umidità. PEG e PNiPAM sono igroscopici45,46 e i gruppi finali funzionali di PEG, PNiPAM e PS sono noti per diventare facilmente ossidato quando memorizzati in condizioni ambientali33,47,48. Tutte le sostanze chimiche devono essere conservate a -20 gradi centigradi. Utilizzare solventi di grado analitico o superiori. Inoltre, utilizzare acqua ultrapura per sciacquare chip e bicchieri a sbalzo AFM perché gli esperimenti a singola molecola sono molto sensibili a tutte le contaminazioni. 2. Impostazione dell’apparecchiatura NOTA: Utilizzare pinzette e becher in acciaio o vetro inossidabile. Utilizzare pinzette invertite per una presa sicura (ad esempio, il modello R3 SA con una costante a molla bassa). Preparare la soluzione RCA (acqua ultrapura, perossido di idrogeno e ammoniaca (5:1:1)) per pulire bicchieri e pinzette. Mettere i vasi in un bicchiere e riempirlo con RCA fino a quando vetro o pinzette sono completamente coperti. Riscaldare il becher da 2,2 per 1 h a 80 gradi centigradi. Risciacquare i vasi con acqua ultrapura fino a quando nessun odore pungente è più accertabile (almeno tre volte). Vetro secco e pinzette in forno (120 gradi centigradi). 3. Funzionalità dei suggerimenti NOTA: Tutti i passaggi devono essere effettuati in una cappa di fumi per evitare l’inalazione di vapori organici. Sono inoltre necessari guanti, camice da laboratorio e protezione per gli occhi. Utilizzare guanti nitrile o lattice per ogni passo per evitare la contaminazione. Indossare guanti resistenti ai solventi quando si utilizza il toluene. Tutti i passaggi, se non diversamente specificato, sono fatti a RT. Utilizzare attrezzature fresche e guanti per ogni passo per evitare possibili contaminazioni incrociate. Eseguire l’attivazione della superficie applicando plasma di ossigeno al chip a sbalzo AFM MLCT-Bio-DC.NOTA: l’efficienza del trattamento al plasma per ulteriori fasi di funzionalizzazione aumenta con il contenuto di ossigeno nella camera al plasma. Utilizzare una pinzetta appena pulita per posizionare i chip a sbalzo AFM in una camera al plasma (40 kHz, 600 W). Utilizzare un programma di attivazione modificato su misura: evacuazione (0,1 mbar) – inondazione di ossigeno a una pressione di: 0,2 mbar (4 min) – processo plasma (potenza: 40%, durata: 2 min, pressione di processo: 0,2 mbar). Ventilate camera e portare avanti con il passo 3.2.2 immediatamente al fine di evitare qualsiasi adsorto di contaminanti a sbalzi di sbalzo AFM dall’aria. Silanizzazione e PEGylationNOTA: la temporizzazione è un parametro critico tra i passaggi. Preparare soluzioni il più fresche possibile durante i tempi di attesa. I gruppi maleimide sono soggetti all’idrolisi nei media acquosi e i tiol diventano facilmente ossidati ai disulfidi nella soluzione33,47 ostacolando le reazioni di funzionalizzazione della punta AFM. Preparare una soluzione silane-PEG-mal in toluene (1,25 mg/mL) in tubi di plastica o vetro resistenti al solvente e versare 6 mL della soluzione in piatti Petri piatti, 3 mL ciascuno.NOTA: se si osserva l’associazione di più polimeri sonda nell’esperimento SMFS, la miscelazione di silane-PEG-mal con silane-PEG non funzionanti può ridurre il numero di punti di ancoraggio. Per la regolazione del livello di passività PEG con masse diverse (ad esempio, lunghezze di contorno) può essere utilizzato27. Incubare i trucioli a sbalzo AFM subito dopo il passaggio 3.1.3 nella soluzione silane-PEG-mal (fino a 10 patatine per piatto Petri) per 3 h a 60 c35. Togliere i piatti Petri dal forno e lasciare raffreddare la soluzione per almeno 10 min. Sciacquare accuratamente ogni chip a sbalzo AFM. Ridurre l’impatto delle forze capillari sul sbalzo AFM quando si passa l’interfaccia anti-solvente, ad esempio inclinando leggermente questi chip durante l’immergersi in soluzione. Per i polimeri PEG e PS, risciacquare tre volte con il toluene. Per il polimero PNiPAM, risciacquare una volta con il toluene e due volte con l’etanolo. Scegli almeno due chip a sbalzo AFM come chip a sbalzo AFM, saltando il passaggio 3.3 e risciacquarli come segue per aumentare la polarità del solvente: Per i polimeri PEG e PS, risciacquare due volte con etanolo e una volta con acqua ultrapura. Per il polimero PNiPAM, risciacquare due volte con acqua ultrapura.NOTA: i chip a sbalzo AFM di controllo hanno superato tutte le fasi di funzionalizzazione ad eccezione dell’attacco polimerico (passaggio 3.3). Servono a dimostrare la pulizia del processo di funzionalizzazione, il sistema di supporto a sbalzo AFM, le superfici e i solventi utilizzati per l’esperimento SMFS. Attacco polimerico covalenteNOTA: Anche se la punta a sbalzo AFM dovrebbe essere completamente coperta da gruppi di maleimide, ci sono solo alcuni siti di legame per il polimero a sonda singola, perché la menimide subisce l’idrolisi nell’acqua che porta a PES inattivi47. Questi FLAG inattivi fungono da livello passivo, come descritto in precedenza. Incubare le chips a sbalzo AFM direttamente dopo il passaggio 3.2.5 in una delle seguenti soluzioni polimeriche in piatti Petri da 3 mL. Se il rispettivo polimero non viene sciolto correttamente, utilizzare un bagno d’acqua di 40 gradi centigradi e mescolare bene la soluzione.NOTA: Poiché l’uso di polimeri terminati potrebbe portare alla formazione di legami disulfide che ostacolano la reazione con i gruppi di maleimide di silano-PEG-mal, si raccomanda un agente di riduzione, in particolare se la fase 3.3 viene applicata in tamponi acquosi per i polimeri solubili in acqua33. Per i polimeri PEG e PS, utilizzare una concentrazione di 1,25 mg/mL in toluene per 1 h a 60 gradi centigradi. Per i polimeri PNiPAM, utilizzare una concentrazione di 1,25 mg/mL in etanolo per 3 h a RT.NOTA: Se si osserva il legame di più polimeri sonda nell’esperimento SMFS, la concentrazione del polimero deve essere ridotta. Risciacquare con cura ogni chip a sbalzo AFM. Per i polimeri PEG e PS, risciacquare due volte con il toluene, due volte con etanolo e una volta con acqua ultrapura dopo 10 min raffreddarsi. Per i polimeri PNiPAM, risciacquare due volte con etanolo e due volte con acqua ultrapura. Conservare ogni chip a sbalzo AFM separatamente in un piccolo piatto Petri (1 mL) riempito con acqua ultrapura a 4 gradi centigradi fino all’uso in un esperimento. 4. Preparazione della superficie Wafer di ossido di silicioNOTA: questa superficie è stata utilizzata per SMFS con PEG e PNiPAM. Tagliare un wafer di ossido di silicio in piccoli pezzi con un coltello di diamante. Mettere i pezzi di ossido di silicio separatamente in tubi di microcentrismo e riempire questi tubi con etanolo. Sonicare i pezzi di ossido di silicio per 10 min. Sciacquare i pezzi di ossido di silicio con etanolo due volte e asciugarli attentamente sotto un flusso di azoto. Utilizzare immediatamente i pezzi di ossido di silicio. Auto-assemblato motrice di alcano idrofobico thiol su oro (SAM)NOTA: questa superficie è stata utilizzata per SMFS con PS. Per ulteriori informazioni sui SAM, vedere la letteratura39,49. Utilizzare un wafer di silicio rivestito d’oro (A [100], 5 nm in titanio, 100 nm oro) per eseguire i passaggi da 4.1.1 – 4.1.4. Incubare i pezzi di superficie in una soluzione 1-dodecanthiol (2 mM) per 18 h. Risciacquare i Camm appena preparati in etanolo due volte. SaM a secco con flusso di azoto per uso diretto o conservarli in etanolo per un massimo di 4 giorni per un uso successivo. 5. Acquisizione dati NOTA: Tutte le misurazioni mostrate qui sono state eseguite in acqua ultrapura con un Cypher ES AFM utilizzando una fase di campionamento di riscaldamento e raffreddamento per la variazione della temperatura. In generale, tutti gli AFU che forniscono la capacità di misurare in liquidi possono essere utilizzati. Inserire il chip a sbalzo AFM funzionalizzato nell’AFM. Incollare la superficie preparata in un supporto campione adatto per la misurazione in liquidi (ad esempio, composto di replica ad alta risoluzione 101RF o un adesivo curabile UV).NOTA: Questi agenti di incollaggio sono altamente inerti e resistenti a un gran numero di solventi polari. La resistenza dell’adesivo ai solventi non polari (ad esempio, toluene o esagonale) o le alte temperature devono essere controllate prima dell’uso. Immergere il chip a sbalzo AFM e il campione di sonda nel liquido, qui: acqua ultrapura.NOTA: Sul supporto del chip a sbalzo AFM può essere depositato un calo di solvente (circa 100 . Coprendo il chip a sbalzo AFM con solvente si riduce le forze capillari, che altrimenti agirebbero sul sbalzo AFM quando si avvicina la superficie del campione che passa attraverso l’interfaccia di solvente d’aria. Se necessario, regolare la temperatura e lasciare che il sistema sia equilibrato.NOTA: I cambiamenti di temperatura possono comportare una deviazione dello sbalzo AFM a causa di un effetto bimetallico per gli sbalzi AFM con un rivestimento riflettente come alluminio o oro. L’equilibratione deve essere eseguita lontano dalla superficie (diversi m) fino a quando non si osserva un ulteriore cambiamento del segnale di deflessione (fino a 15 minuti per MLCT-Bio-DC). Variare la temperatura in modo casuale per escludere eventuali effetti dell’invecchiamento della funzionalizzazione. Assicurarsi che le temperature applicate non portino ad una flessione irreversibile dello sbalzo AFM.NOTA: eventuali effetti di temperatura sulle proprietà del solvente (come evaporazione o cambiamenti nella viscosità) potrebbero ostacolare gli esperimenti. Negli esempi presentati, la temperatura è stata variata su un intervallo fino a 40 K in gradini di 10 K prendendo l’acqua come solvente (ad esempio, da 278 K a 318 K). Avvicinarsi alla superficie per determinare l’InvOLS (sensibilità della leva ottica inversa) prendendo curve di estensione della forza su una superficie dura (come l’ossido di silicio). Per questo, prendere il segnale di deflessione del fotodetectore (in V) vs distanza piezo e determinare la pendenza della parte che rappresenta l’indentazione della punta a sbalzo AFM nella superficie sottostante (regime repulsivo) utilizzando una funzione lineare. Per ridurre gli errori, prendere la media di almeno cinque valori per ottenere il valore InvOLS finale. Per ulteriori dettagli, vedere la letteratura4,39.NOTA: l’InvOLS può essere determinato in modo affidabile solo su superfici dure. Nel caso di esperimenti su superfici o interfacce morbide, assicurarsi di posizionare una superficie dura vicino alle superfici morbide. Quindi, la calibrazione InvOLS può essere eseguita prima o dopo gli esperimenti di superficie morbida senza la necessità di smontare l’impostazione AFM. Per la determinazione costante della molla, spostare il sbalzo AFM ad un’altezza senza interazioni attraenti né repulsive tra la punta e la superficie a sbalzo AFM (diversi m). Quindi, registrare uno spettro di rumore termico in cui viene tracciata la densità spettrale di potenza (PSD) e la frequenza. I seguenti passaggi sono di solito eseguiti da funzioni integrate automatizzate nel software aFM commerciale: in primo luogo, lo spettro del rumore termico acquisito viene analizzato montando una funzione al PSD, ad esempio, un semplice oscillatore armonico (SHO). La vestibilità è fatta fino al minimo tra la prima e la seconda risonanza. In secondo luogo, viene determinata l’area sotto la parte adattata del plott on frequency PSD che rappresenta lo spostamento quadrato medio del cantilever AFM in direzione verticale. Infine, il teorema dell’equipartizione viene utilizzato per ottenere la costante di forza a sbalzo AFM28,50.NOTA: Deve essere utilizzato un intervallo di frequenza appropriato che comprenda il primo picco di risonanza dello sbalzo AFM. Per ottenere un rapporto segnale-rumore soddisfacente, è necessario accumulare almeno 10 PSD con la massima risoluzione di frequenza possibile. Avviare l’esperimento. Registrare le mappe di forza prendendo curve di estensione della forza in modo simile a una griglia (ad esempio, 10 x 10 punti per un’area di 20 x 20 m2) per evitare effetti superficiali locali (ad esempio, impurità, lussazioni) e per una media di diverse aree di superficie.NOTA: I parametri tipici sono una velocità di trazione di 1 m/s e una velocità di campionamento di 5 kHz per garantire una risoluzione sufficiente. La frequenza di campionamento deve essere adattata quando la velocità di trazione è varia. La distanza di ritrazione deve essere adattata alla lunghezza del contorno o della desorption del polimero misurato (circa il doppio della lunghezza prevista). Utilizzare e variare il tempo di permane verso la superficie per consentire al singolo polimero di aderire alla superficie (in genere da 0 a 5 s). Ripetere la determinazione dell’InvOLS e della costante di molla alla fine dell’esperimento per verificare la coerenza e la stabilità del sistema.NOTA: per una forte adesione tra polimero e superficie, la calibrazione può essere eseguita dopo l’esperimento vero e proprio per preservare la funzionalizzazione. 6. Valutazione dei dati NOTA: per la valutazione dei dati, è stato utilizzato un software personalizzato basato su Igor Pro per eseguire i seguenti passaggi. Convertire il segnale di deflessione non elaborato (in Volts) in valori di forza (in Newton) moltiplicando con l’InvOLS registrato e la costante a molla determinata. Sottrarre la deflessione del cantilever AFM (dopo la moltiplicazione del segnale di deflessione grezza con InvOLS) dalla distanza percorsa dagli elementi piezoini in direzione verticale al fine di ottenere la vera estensione (distanza della superficie di punta)4. Correggere le curve di estensione della forza ottenute per la deriva adattando una funzione lineare alla linea di base dopo l’ultimo evento e sottraendo lo stesso dalla curva di estensione della forza. La parte montata dovrebbe rappresentare un’estensione sufficiente dalla superficie in cui non si osservano interazioni attraenti né repulsive tra la punta a sbalzo AFM e la superficie sottostante. Quindi, la linea di base viene impostata sull’asse zero.NOTA: Nel caso di misurazioni su superfici altamente riflettenti come l’oro, potrebbero comparire interferenze. Questi derivano da una riflessione parziale del raggio laser dalla superficie e dal retro dello sbalzo AFM. Così, le curve di estensione della forza ottenute potrebbero mostrare un artefatto di segnale di forza sinusoidale lungo l’estensione verticale. Questo è un artefatto che ostacola i valori di forza finali. Per tenere ancora conto di queste curve di estensione della forza, è possibile una correzione (Figura 2). Se le interferenze appaiono nelle curve di estensione della forza, selezionare una curva di estensione della forza rappresentativa (curva di retrazione) che mostri nessun altro evento che un picco di aderenza non specifica e lo stesso artefatto sinusoidale (cioè ampiezza e fase) (Figura 2A).NOTA: Smussare la curva di estensione della forza rappresentativa per ottenere il modello di bassa frequenza dell’interferenza. Selezionare una curva di estensione della forza da correggere (Figura 2B). Sovrapporre entrambe le curve di estensione della forza dai passaggi 6.4. e 6,5. per assicurarsi che entrambi mostrino lo stesso artefatto sinusoidale (cioè ampiezza e fase) (Figura 2C). Sottrarre la curva di estensione della forza rappresentativa (levigata) dalla curva di estensione della forza da correggere portando a una linea di base lineare anziché a una linea di base sinusoidale (Figura 2D).NOTA: fare attenzione che il picco di adesione non specifico della curva rappresentativa sia distinto da tutti gli eventi di singola molecola che appaiono nelle curve da correggere. Infatti, la selezione della curva rappresentativa è fondamentale per una corretta correzione.

Representative Results

Gli esempi seguenti mostrano i risultati dell’allungamento e della desorption delle singole molecole nei modelli PEG, PNiPAM e PS. Tutti i suggerimenti a sbalzo AFM sono stati funzionalizzati con il protocollo indicato sopra. PEG e PNiPAM sono stati misurati su SiOx con variazione di temperatura. Per una discussione dettagliata delle curve di stiramento dipendenti dalla temperatura risultanti per PEG e PNiPAM, vedere Kolberg et al.18 Un diverso motivo di estensione della forza è un altopiano di forza costante (ad esempio, quando desorbing PS da monostrati auto-assemblati di thiols metili terminati su oro (SAM) in acqua4,27,39,51). Esempio 1: allungamento del PEG e del PNiPAM in acquaIl comportamento di stiramento dipendente dalla temperatura in acqua è stato misurato utilizzando singoli polimeri PNiPAM e PEG legati in modo covalente a una punta a sbalzo AFM ad un’estremità e physisorbed su una superficie SiOx all’altra estremità. Dopo gli esperimenti di calibrazione e controllo pulito (meno del 2% delle curve di estensione della forza mostra eventi a singola molecola), sono state registrate almeno due mappe di forza per ogni sbalzo AFM. L’esperimento dipendente dalla temperatura è stato effettuato registrando almeno una mappa della forza ad ogni temperatura. Quando sono apparsi solo pochi eventi di stretching, il rispettivo cantilever AFM è stato scartato e il successivo sbalzo AFM del chip è stato preso (di solito nell’ordine C, B, D ed E di MLCT-Bio-DC). Per i dati esemplari di PEG, è stato osservato un singolo evento di stiramento in 95 su 500 curve di estensione della forza misurate (19%). Per PNiPAM, 252 curve di estensione della forza su 600 hanno mostrato un modello di stiramento (42%). Per un migliore confronto delle curve di estensione della forza, è stata generata una singola curva principale per ogni temperatura. A tale scopo, sono state scelte solo quelle curve con un evento di stiramento ad almeno 500 pN, dove le fluttuazioni conformazionali e gli effetti dei solventi sono trascurabili, sono state scelte52. Il numero finale di tratti presi in considerazione è stato 3 a 278 K, 7 a 298 K e 4 a 318 K per PEG e 4 a 278 K, 3 a 298 K e 3 a 318 K per PNiPAM18. La procedura per la generazione di curve principali è descritta nella figura 3. Le curve di estensione della forza scelte (Figura 3A) vengono ridimensionate a una lunghezza L0 (estensione a una forza di 500 pN), vedere la figura 3B. Il picco di adesione mostra una grande variazione di adesione non specifica tra la superficie e la punta a sbalzo AFM, ma non influenza il comportamento di stiramento del polimero. Dopo la fusione delle curve di estensione della forza ridimensionate, esse sono mediate da una levigatura binominale come illustrato nella figura 3C. Per questo, un filtro gaussiano convolsce i dati con coefficienti normalizzati derivati dal triangolo di Pascal ad un livello uguale al parametro di levigatura 2053. Infine, si ottiene una curva master ad ogni temperatura come indicato nella Figura 3D. Lo zoom-in mostra l’intervallo in cui l’effetto della temperatura sul comportamento di estensione della forza è più pronunciato. Un confronto tra il comportamento della temperatura di PEG (A) e PNiPAM (B) è disponibile nella Figura 4. Per PEG è stata osservata una diminuzione della forza di stiramento con l’aumento della temperatura. Un aumento di circa il 5% dell’estensione ridimensionata a 100 pN è stato osservato quando si aumenta la temperatura da 278 a 318 K. Per PNiPAM, potrebbe essere rivelato uno spostamento opposto dipendente dalla temperatura. Inoltre, è stata osservata una diminuzione di circa l’1% dell’estensione di riscala a 100 pN quando la temperatura è stata aumentata da 278 a 328 K. Inoltre, l’energia libera di stiramento potrebbe essere ottenuta dalle curve master di estensione della forza determinando l’area sotto la curva per un dato valore di forza. Questo potrebbe essere utilizzato per estrarre contributi energetici e entroci dell’allungamento dell’energia libera con l’aiuto di simulazioni di dinamica molecolare (MD)18. Esempio 2: Descrizione di PS da una superficie SAM in acquaLa desorption di PS da una superficie SAM in acqua potrebbe essere utilizzata per determinare la forza e la lunghezza di desorption e quindi quantificare l’interazione idrofobica. Dopo la calibrazione, almeno due mappe di forza sono state registrate in due punti diversi della superficie. Quando l’attacco del polimero ha avuto esito positivo, le curve di estensione della forza hanno mostrato altipiani di forza costante, come caratteristica, vedere Figura 5A e Figura 5C. La desorptizione simile all’altopiano si osserva quando la dinamica dei legami sondati è molto più veloce del tasso di trazione della punta a sbalzo AFM (quasi-equilibrio). Le forze di desorption delle curve di estensione della forza simili all’altopiano forniscono direttamente energie libere di adesione integrando la traccia di estensione della forza54. Sono stati utilizzati per determinare le interazioni elettrostatiche, dispersive e idrofobiche, nonché le proprietà di attrito di singoli polimeri sulle superfici in ambiente liquido2,4,23,51,54,55. Ogni altopiano di forza costante era dotato di una curva sigmoidale per determinare la forza di desorption e la lunghezza della desorption, che sono stati poi tracciati in istogrammi. Gli istogrammi erano dotati di un gaussiano per estrarre il valore massimo e la deviazione standard. Per una migliore panoramica, i valori di forza e lunghezza di desorption sono stati visualizzati insieme in un grafico a dispersione, come illustrato in Figura 5B e Figura 5D. Per il polistirolo su SAM in acqua, le forze di desorption determinate corrispondono ai valori precedentemente ottenuti19,23. Poiché la lunghezza del desorption è correlata alla lunghezza del contorno polimerico51, la distribuzione della lunghezza del desorption può essere utilizzata come prova del legame covalente del rispettivo polimero alla punta a sbalzo AFM tramite il suo gruppo finale funzionale. Così, la lunghezza di desorption serve come un’impronta digitale. Per più di un polimero attaccato alla punta a sbalzo AFM, si possono osservare cascate di altipiani (passi discreti) nelle curve di estensione della forza56. Ogni altopiano rappresenta la desorption di un polimero ad un’estensione diversa. L’esperimento illustrato in Figura 5C e Figura 5D ha mostrato un tipico caso di due polimeri collegati alla punta a sbalzo AFM allo stesso tempo. Montando la rottura finale, si poteva trovare una distribuzione bimodale per la lunghezza della desorption, mentre la forza di desorption mostrava una distribuzione ristretta. In questo caso, la lunghezza più piccola della desorption potrebbe essere trovata nel 90% delle curve di estensione della forza, sia come un altopiano o come un altopiano aggiuntivo sull’altopiano più lungo, come indicato nella Figura 5C. La maggiore lunghezza di desorption è stata trovata nel 37% delle curve di estensione della forza ottenute. Pertanto, la distribuzione della lunghezza di desorption potrebbe essere utilizzata per determinare il numero di diversi polimeri attaccati alla punta a sbalzo AFM. In generale, una distribuzione ristretta dei valori di lunghezza desorption è una buona indicazione che uno e lo stesso singolo polimero è stato sondato nelle curve di estensione della forza ottenute. Allo stesso tempo, una sovrapposizione delle rispettive forze-estensione può essere utilizzata per decidere se uno e lo stesso singolo polimero è stato misurato. Dopo aver dimostrato il legame covalente di un singolo polimero PS, ulteriori esperimenti con questo polimero PS possono essere eseguiti substrato variabile (superficie solida e pellicole polimeriche), condizioni di solvente, temperatura, velocità di trazione o tempo di permanemento. Figura 1: Panoramica schematica del processo di funzionalizzazione dei suggerimenti. Include la modifica chimica della punta a sbalzo AFM dopo (1) attivazione al plasma (2) indalizzazione/PEGylation e (3) attaccamento polimerico. Inoltre, vengono mostrate le strutture chimiche dettagliate dei polimeri utilizzati, vale a dire PEG, PNiPAM e PS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Eliminazione delle interferenze nelle curve di estensione della forza. (A) Trovare una curva di estensione della forza che mostri un artefatto di segnale di forza sinusoidale lungo l’estensione, ma non avendo un singolo evento di estensione molecola. (B) Scegliere una curva di estensione della forza con un evento di singola molecola, che deve essere corretta dall’artefatto sinusoidale. (C) Sopporre le curve per controllare se gli artefatti sinusoidali delle curve corrispondono davvero. (D) Sottraendo la curva di estensione della forza (A) da (B) si ottiene una curva di estensione della forza con una linea di base retta. Anche se il picco di adesione non può essere utilizzato per ulteriori analisi, la curva di estensione della forza è ora corretta per l’artefatto che porta a valori di forza molto più precisi nella regione dell’evento a singola molecola (qui: > 0,2 m di estensione). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Determinazione delle curve principali dalle curve di estensione della forza di PEG a 298 K. (A) Dati sperimentali a 298 K, utilizzando 7 curve di estensione della forza. Dopo il ridimensionamento a una lunghezza L0 con una forza di 500 pN (B), le curve di estensione della forza possono essere unite e mediate mediante l’arrotondamento binominale ottenendo una curva principale (C). Le curve ridimensionate vengono date come punti mentre la curva principale viene visualizzata come una linea continua. Infine, le curve principali ottenute per temperature diverse possono essere confrontate (D). Lo zoom indica l’intervallo in cui l’effetto della temperatura sul comportamento dell’estensione della forza è più pronunciato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Confronto delle curve master dipendenti dalla temperatura di PNiPAM e PEG. Per PEG si osserva un aumento dell’estensione ridimensionata a 100 pN (intervallo di forza media) quando si aumenta la temperatura (A), mentre per PNiPAM viene rivelato uno spostamento opposto dipendente dalla temperatura (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Analisi delle curve di estensione della forza di PS su SAM in acqua. (A) Curva esemplare di estensione della forza (blu) con una vestibilità sigmoidale dell’altopiano (viola). Inoltre, le frecce contrassegnano la forza determinata (rosso) e la lunghezza (verde) dell’altopiano. I valori di forza desorption e lunghezza desorption ottenuti da attacchi sigmoidali sono visualizzati in un grafico a dispersione e gli istogrammi risultanti sono dotati di un gaussiano. (B) La forza di desorption media determinata e i valori di lunghezza desorption sono (112 x 6) pN e (659 – 7) nm, in cui il 93% delle curve di estensione della forza mostra tali eventi di altopiano. (C) Curva di estensione della forza esemplare (blu) per due polimeri attaccati contemporaneamente alla punta a sbalzo AFM. In questo caso, la forza di desorption mostra una distribuzione unimodale con un valore di forza medio di (117 – 5) pN, mentre è possibile trovare una distribuzione bimodale per la lunghezza di desorption che porta a valori di lunghezza media di (656 x 9) nm e (1050 – 16) nm. (D) Il 90% delle curve di estensione della forza campionate mostra solo eventi di altopiano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

SMFS basato su AFM è uno dei principali strumenti per studiare le interazioni di una singola molecola nella fisica dei polimeri. Per un vero esperimento a singola molecola, l’attaccamento covalente del polimero della sonda a una punta a sbalzo AFM è essenziale.

Molti lavori precedenti si basano su esperimenti di nanopesca, in particolare per PNiPAM, dove i polimeri vengono adsorbiti su una superficie e poi allungati raccogliendoli casualmente dal substrato utilizzando una punta a sbalzo AFM30,31. Questo potrebbe alterare i risultati e portare a un’errata interpretazione del comportamento della singola molecola. Lì, gli effetti cooperativi potrebbero dominare i risultati perché le interazioni con i polimeri vicini non possono essere escluse. Questo ha un grande impatto sui risultati, soprattutto per i polimeri che mostrano un comportamento significativamente diverso alla rinfusa rispetto alle singole molecole isolate57,58.

Il protocollo di funzionalizzazione qui presentato è affidabile e può essere facilmente applicato a diversi polimeri, indipendentemente dalla loro lunghezza del contorno, dall’idrofobicità o dall’ostacolo sterico dei monomeri. Inoltre, viene fornita una passività per prevenire interazioni indesiderate tra il polimero a sonda singola e la punta a sbalzo AFM, nonché tra la punta a sbalzo AFM e la superficie sottostante. Inoltre, viene mostrata la valutazione delle curve di estensione della forza che mostrano gli eventi di stiramento. Lì, viene proposta una procedura per la determinazione delle curve principali di estensione della forza. Questo offre un mezzo migliore per rivelare, ad esempio, gli effetti relativi alla temperatura sul comportamento di estensione della forza. Inoltre, viene fornita l’analisi di eventi di desorption a singola molecola con altipiani di forza costanti. Inoltre, viene fornito un modo semplice per correggere gli artefatti del segnale di forza sinusoidale nelle curve di estensione della forza che potrebbero altrimenti compromettere i risultati dell’esperimento.

Rispetto a Stetter et al.39, la procedura di funzionalizzazione qui presentata è ridotta a tre passaggi invece di quattro e la robustezza della procedura è migliorata. Il principale vantaggio di eseguire PEGylation e silanization in un unico passaggio è quello di avere una reazione più controllata e di aumentare la resa. Inoltre, è necessario preparare un minor numero di soluzioni e sono necessarie meno misure di risciacquo. Questo riduce lo sforzo e il tempo per la preparazione e aumenta la riproducibilità. Inoltre, lo spostamento di sbalzi AFM è sempre una parte fondamentale del processo di funzionalizzazione. Un trasferimento da una soluzione all’altra corre sempre il rischio di influenzare fortemente la qualità della funzionalizzazione a causa dei trasferimenti attraverso l’interfaccia aria-acqua o di perdere i cantilever AFM con un uso improprio di pinzette.

Al fine di dimostrare il corretto attaccamento covalente di un singolo polimero ad una punta a sbalzo AFM devono essere soddisfatte diverse condizioni. In primo luogo, i cantilever AFM di controllo sono di notevole importanza e devono essere preparati per ogni funzionalizzazione. Il processo di funzionalizzazione e la cella fluida per l’esecuzione degli esperimenti sono considerati puliti solo se un piccolo numero di curve di estensione della forza mostra novidi o altipiani nell’esperimento di controllo (negli esempi presentati meno del 2%).

Un chiaro modello di stiramento senza ulteriori gocce o maxima è essenziale per avere eventi di stretching a singola molecola. Inoltre, la dipendenza della forza di rottura sulla velocità di carico della forza alla rottura o la risposta elastica completa della curva di stiramento deve essere analizzata al fine di escludere la desorpazione simultanea di più polimeri59,60. Per PEG e PNiPAM, il 19% e il 42% delle curve di estensione della forza prese in diverse posizioni della superficie hanno mostrato un tale modello di stiramento, rispettivamente. Per ottenere eventi di stretching, la fisiologia del polimero alla rispettiva superficie sottostante deve essere forte. In caso contrario, viene osservato un evento di desorption simile all’altopiano. Questo è ancora più decisivo per il rilevamento di eventi di stretching ad alte forze (fino a 500 pN o più). Poiché questo forte physisorption non è soddisfatto per ogni curva di estensione della forza, la resa di tali eventi è inferiore a quella per gli eventi di desorption puramente simili ad altipiani. In alternativa, possono essere utilizzati gruppi fortemente aderenti come catecholoos o chemisorption tra polimero e superficie sottostante. Tuttavia, ciò richiede l’introduzione di ulteriori gruppi funzionali o siti di accoppiamento al polimero61,62.

Infatti, la massa (cioè la lunghezza del contorno) del polimero fornisce una preziosa impronta digitale. Anche se la massa non può essere tradotta direttamente nella lunghezza del contorno misurata per i seguenti motivi, la distribuzione della lunghezza è molto preziosa per definire eventi a singola molecola. Nel caso di un polimero PNiPAM con unaƉ bassa polidisità (1,28 dollari), abbiamo riscontrato differenze significative nei valori di estensione per gli eventi di stretching ottenuti (e quindi nella lunghezza del polimero) negli esperimenti. Una ragione di ciò potrebbe essere la determinazione della lunghezza del polimero e della sua distribuzione. Nella cromatografia ad esclusione di dimensioni (SEC), un peso relativo del polimero bersaglio è determinato rispetto a standard come PS o poli (methacryla metile) (PMMA)63. Si prevede che il peso relativo presunto si discosti dal peso molecolare assoluto perché il raggio idrodinamico del polimero bersaglio e lo standard possono differire in modo significativo. Inoltre, lo strato silano potrebbe essere oligomerizzato da acqua spuria in toluene durante il processo di funzionalizzazione. L’attaccamento di tali oligomeri alla punta a sbalzo AFM porta ad uno strato più flessibile con meno punti di ancoraggio64. Inoltre, il punto di attacco del polimero allo strato di silicio potrebbe non essere necessariamente all’apice che porta a uno spostamento dei valori di lunghezza rilevati29. Mentre un modello polimerico come la catena wormlike (WLC) o il modello a catena liberamente congiunta (FJC) non può riprodurre il rispettivo comportamento di estensione della forza per PEG o PNiPAM correttamente su tutta la gamma di estensione18,29,41,65,66, un modello polimerico potrebbe essere prezioso per altri sistemi polimerici e proteici10,15,67,68.

L’attaccamento covalente di un singolo polimero PS (con una lunghezza del contorno superiore a 1 m) è considerato efficace solo quando un numero considerevole di curve di estensione della forza mostra un altopiano abbastanza lungo di forza costante (Figura 5). Un altopiano risultante dal desorbing di un singolo polimero è definito da una singola caduta netta di una forza costante alla linea di base ad una certa estensione, come indicato nella Figura 5A. Se più polimeri sono attaccati alla punta a sbalzo AFM, si osserva una cascata di altipiani56 (Figura 5C). La lunghezza dell’altopiano (lunghezza del disidrato), correlato con la lunghezza del contorno polimerico51, deve essere significativamente più lunga di qualsiasi picco di adesione a causa dell’adesione non specifica della punta a sbalzo AFM alla superficie sottostante (qui circa 200 nm). Le lavorazioni che appaiono esclusivamente in una singola curva di estensione della forza, non devono essere interpretate. Negli esperimenti presentati, almeno 80 curve su 100 hanno mostrato un altopiano più lungo di 200 nm in almeno due mappe di forza in due punti diversi sulla superficie. Inoltre, la distribuzione delle lunghezze di desorption, utilizzando grafici a dispersione come indicato in Figura 5B e 5D, rivelano se e quanti polimeri sono legati alla punta a sbalzo AFM. Nel caso di PS, una distribuzione ristretta della forza di desorption e della lunghezza prelevata dagli altipiani delle curve di estensione della forza è servita come prova di un attaccamento covalente di successo. Questo alla fine ha dimostrato il successo del protocollo di funzionalizzazione. Pertanto, raccomandiamo vivamente di presentare tali distribuzioni di forza e lunghezza nelle pubblicazioni.

La valutazione delle curve di estensione della forza utilizzando algoritmi incorporati che comprendono molti parametri preimpostati deve essere eseguita con attenzione. I motivi sono, ad esempio, che una frequenza di campionamento fissa non è appropriata per ogni velocità di trazione applicata o che un arrotondamento automatico delle curve di estensione della forza potrebbe mediare i dettagli importanti. Di solito una corretta comprensione della rispettiva procedura di valutazione può prevenire errori nella procedura di valutazione, che a sua volta può influenzare fortemente i risultati finali di un esperimento SMFS basato sull’AFM.

In sintesi, presentiamo un protocollo di funzionalizzazione che è affidabile e può essere facilmente applicato a una varietà di polimeri. Inoltre, viene presentata una corretta valutazione delle curve di estensione della forza a singola molecola, consentendo la determinazione di parametri fisici come la forza di stiramento, la forza di desorption e la lunghezza della desorption. I protocolli e le procedure presentati sono preziosi per lo studio di sistemi che rispondono agli stimoli a livello di singola molecola.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

B.N.B. e T.H. riconoscono il finanziamento della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) nell’ambito della strategia di eccellenza della Germania – EXC-2193/1 – 390951807, gef’rdert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenz des Bundes und der L’nder – EXC-2193/1 – 390951807, e concedere la sovvenzione HU 997/1-13 (progetto n. 420798410). M.G. riconosce un sostegno parziale nell’ambito del PROGETTO LOEWE iNAPO da parte del Ministero dell’Istruzione superiore, della Ricerca e delle Arti dell’Assia. Ringraziamo la Dott.ssa Wolfgang Bronner e la Dott.ssa Agne ‘ukauskaite del Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF per la donazione di wafer di silicio rivestiti d’oro di alta qualità.

Materials

1-Dodecanethiol (≥98%) Sigma-Aldrich, USA 417364-500ML Used for SAM
Ammonia solution (30%) Roth, Germany CP17.2 Used for cleaning
Cypher ES Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA – AFM
Ethanol (≥99.9%) Roth, Germany PO76.1 Solvent
Gold coated silicon wafer Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany – Used for SAM
High Resolution Replicating Compound Microset Products Ltd, UK 101RF Bonding agent
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich, USA H1009 Used for cleaning
Igor Pro Wavemetrics, USA – Software environment
Tetra-30-LF-PC Diener Electronic, Germany – Plasma chamber
Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane Creative PEG works, USA PHB-1923 Linker polymer
MLCT-Bio-DC Bruker, USA MLCT-Bio-DC AFM cantilever
Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV < 10 µm MicroChemicals, Germany WSA40600250 P1314SNN1 Silicon wafer
Purelab Chorus 1, 18.2 MΩ cm Elga LabWater, Germany 10034-540 Ultrapure water source
R3 SA Vomm GmbH, Germany 5803 Blank Tweezers
Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide) Gallei Group, Saarland University, Germany – PNiPAM probe polymer
Thiol terminated polystyrene Polymer Source, Canada P40722-SSH PS probe polymer
Thiol-polyethylene glycol-thiol Creative PEGWorks, USA PSB-615 PEG probe polymer
Toluene (99.99%) Fisher Chemicals T324-500 Solvent
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Kolberg, A., Wenzel, C., Hugel, T., Gallei, M., Balzer, B. N. Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (157), e60934, doi:10.3791/60934 (2020).
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