JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

חיבור קוולנטי של מולקולות בודדות לספקטרוסקופיית כוחות מבוססי AFM

Published: March 16, 2020
doi:
10.3791/60934
, , , ,
1Institute of Physical Chemistry,Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, 2Chair in Polymer Chemistry,Saarland University, 3Cluster of Excellence livMatS at FIT – Freiburg Center for Interactive Materials and Bioinspired Technologies,University of Freiburg

Summary

החזקה הקוולנטי של מולקולות בדיקה למיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מהווה טכניקה חיונית לחקירת התכונות הפיזיות שלהם. זה מאפשר לנו לקבוע את כוח מתיחה, כוח desorption אורך של פולימרים באמצעות AFM מבוססי כוח מולקולה בודדת ספקטרוסקופיה עם היכולת הגבוהה.

Abstract

מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) המבוסס על מולקולה בודדת ספקטרוסקופיית בודד הוא כלי אידיאלי לחקירת האינטראקציות בין פולימר בודד משטחים. עבור ניסוי מולקולה בודדת אמיתית, המצורף הקוולנטי של המולקולה בדיקה הוא חיוני כי רק אז יכול להיות מאות עקבות הארכה כוח עם אחד ואת אותה מולקולה אחת לקבל. עקבות רבים הם בתורו הכרחי כדי להוכיח כי מולקולה אחת לבד הוא נחקר. בנוסף, פסיבציה חיונית למניעת אינטראקציות לא רצויות בין מולקולת הגשושית היחידה לבין קצה הזיז של AFM, כמו גם בין קצה הזיז של AFM לבין המשטח המשמש כבסיס. פרוטוקול הפונקציונליזציה המוצג כאן הוא אמין וניתן להחילם בקלות על מגוון פולימרים. אירועים אופייניים מולקולה אחת (כלומר, מתיחות ומישורים) מזוהים בעקבות הארכת כוח. מאירועים אלה, פרמטרים פיזיים כגון כוח מתיחה, כוח desorption ואורך desorption ניתן להשיג. דבר זה חשוב במיוחד לחקירה המדויקת של מערכות תגובה לגירויים ברמת המולקולה הבודדת. כמו מערכות למופת פולי (אתילן גליקול) (פג), פולי (N-איזופסילאמיל) (pniפם) ו פוליסטירן (PS) הם נמתח ו desorbed מ-SiOx (עבור יתד ו pniפם) ומפני הידרופובי עצמית התאספו משטחי דופלקס (עבור PS) בסביבה ימית.

Introduction

מאז ההמצאה שלובשנות ה-80,מיקרוסקופ כוח אטומי (afm) הפכה לאחת הטכניקות החשובות ביותר הדמיה במדעי הטבע שמציעות sub-nanometer רחב הרזולוציה מרחבית, sub-piconewton החלטה כוח האפשרות של מדידה בתנאי הממס השונים טמפרטורה2,3,4,5,6,7.

מלבד הדמיה8,9, afm משמש לבצע בודד מולקולה כוח ספקטרוסקופיית (smfs) נותן תובנה בין אינטראקציות דבק בין פולימר בודד משטחים, תכונות פיזיות של פולימרים יחיד ומנגנונים התגלגלות של חלבונים7,10,11,12,13,14,15,16. בניסוי ה-SMFS הרגיל, מובא קצה התנועה הפונקציונלי במגע עם משטח, כך שפולימר בתוך הזיז הפיזי של AFM לפני השטח הזה. על ידי החלפת קצה הזיז של AFM מפני השטח, שינוי בהטיה של הזיז ה-AFM מומר לכוח המוביל לעקומת כוח מאריך4. פרמטרים פיזיים כגון כוח מתיחה, כוח desorption ו desorption אורך יכול להיקבע תלוי פרמטרים שונים כגון מהירות משיכת, זמן להתעכב על פני השטח, כניסות עומק לתוך פני השטח, טמפרטורה, ממס17,18 ומשטחים שונים כמו מצעים מוצק, סרטים פולימריים או ליפיד bilayers19,20,21,22 יתר על כן, פולימר יכול להיות נחקר בכיוונים מרחביים שונים, ובכך לחקור את המאפיינים הפריקטיונאל של פולימר23,24,25,26.

החזקה הקוולנטי של הפולימר הנחקר לקצה הזיז של AFM הוא חיוני למחקרים כאלה. Thus, תשואה גבוהה של אירועים מולקולה אחת עם אחד ופולימר אותו מאוגד לקצה הזיז afm המונע כל הטיה של התוצאות בשל כיול של קבוע האביב של ה-afm זיז27,28, משתנה קבצים מצורפים29 או פולימרים שונים (עם אורכי מתאר שונים) כמו במקרה של ניסויים ננודיג30,31,32. כמו כן, ניתן למנוע באופן נרחב אינטראקציות עם פולימרים אחרים, כמו גם ממוצע אפקטים של18,28. עבור ההחזקה הקוולונה של פולימר לקצה הזיז של AFM, ניתן ליישם סוגים שונים של שינויים כימיים, שרבים מהם מסוכמים בספר על ידי הרמנסון33. אמין ו-thiol מבוססי מקשר תגובות, כמו גם כימיה לחץ לייצג את השיטות הנפוצות ביותר בשימוש הנפוץ ביותר של afm מקצהמ34,35,36,37,38,39,40,41,42. Becke et al.40 להראות כיצד להשתמש 1-אתיל-3-(3-dimethylaminopropyl) כימיה של הכימיה (edc)/nhs כדי לחבר חלבון לקצה הזיז afm. עם זאת, הקבוצות הפונקציונלי אמר נוטים לעבור crosslink, ובכך מובילה אובדן של פונקציונליות43,44. כמו כן, בקרבודידים מראים נטייה להידרוליזה מהירה בתמיסה43. מאלאימיד וקבוצות תיול הן בדרך כלל יציבות יותר ולא מציגות תגובות מקושרות. הפרוטוקול המוצג הוא אופטימיזציה של הפרוטוקולים שפורסמו בעבר שניתנו בהפניות35,39.

כאן, פרוטוקול פונקציונליזציה אמין מוצג כי ניתן לכוונן בקלות למספר רב של פולימרים שונים, ללא קשר למאפיינים כגון אורך מתאר או הידרופוטביטי. שלושה פולימרים שונים נבחרו בדרך לדוגמה: פוליאתילן הידרופילי גליקול (פג) ו פולי (N-איזופסילאמיל) (Pniפם), כמו גם קלקר גבוה הידרופובי בכמויות (PS). על מנת לספק יכולת קשירה מובנית עם מולקולת מקשר מתאימה, שלושת הפולימרים נבחרו למציגים את הmoiety הטלצ’למית בתור קבוצת הסיום הפונקציונלית. מולקולת המקשר עצמה היא בדרך כלל פולימר מקוצר קצר עם שני אתרים פעילים, קבוצה silane בקצה אחד וקבוצה maleimide בקצה השני. הראשון מאפשר חיבור קוולנטי לקצה הזיז של afm והאחרון הוא תגובה מחייבת עם קבוצת תיול של פולימר גבוה המוני טוחנת המסה. יתר על כן, מולקולות לא פעיל של מקשר יתד לשמש כשכבת פסיבציה כדי למנוע אינטראקציות לא רצויות בין פולימר הבדיקה ואת קצה הזיז AFM, כמו גם בין קצה הזיז AFM ואת המשטח הבסיסי.

Protocol

הערה: ראה איור 1 עבור סקירה סכמטית. 1. התקנה מגיב הערה: הפולימרים המשמשים לפרוטוקול זה הם: מלאימיד-פוליאתילן גליקול-triethoxysilane (silane-פג-mal, 5 kda), תיול-פוליאתילן גליקול-תיול (HS-יתד-SH, 35 kda), תיול סיים פולי (N-איזוקסילאמיד) (pniפם-sh, 637 kda) ו-תיול הסתיים פוליסטירן (PS-sh, 1.3 מד א). הכינו את המסה הטובה והגבוהה טוחנת pnipam-SH באמצעות אטום העברת פולימוניזציה רדיקלי, ואחריו המרה וצמצום של קבוצת הסיום תפקודית למבוא של תיול moiety, כפי שמתואר בספרות18. נא ראה איור 1 עבור המבנים המפורטים. לאחסון של כימיקלים, להכין מערכות קטנות יותר בתוך מערכת כפפות יבש עם אווירת חנקן כדי למנוע חשיפה לחמצן אטמוספרי ולחות. יתד ו pnipam הם דייב45,46 ואת קבוצות סוף פונקציונלי של יתד, pnipam ו PS ידועים להיות תחמוצת בקלות כאשר מאוחסן בתנאים33הסביבה 33,47,48. כל הכימיקלים צריך להיות מאוחסן ב-20 ° c. השתמש בממסי כיתה אנליטית ומעלה. יתר על כן, להשתמש במים אלקטרופורזה לשטוף שבבי afm התלויה וכלי זכוכית, כי ניסויים בודדים מולקולה רגישים מאוד כל זיהום. 2. התקנת ציוד הערה: השתמש בפינצטה ובספלים עשויים נירוסטה או זכוכית. השתמש בפינצטה הפוכה לאחיזה בטוחה (למשל, דגם R3 SA בעל קבוע קפיץ נמוך). הכינו RCA (מים באולטרטהורים, מי חמצן ואמוניה (5:1:1)) פתרון לניקוי כלי זכוכית ומלקחיים. הניחו את כלי הקיבול בגביע ומלאו אותו ב-RCA עד שכלי הזכוכית או הפינצטה מכוסים במלואו. לחמם את הגביע משלב 2.2 עבור 1 h ב 80 ° c. שטפו את הכלים לאחר מכן עם מים אולטרה-טהורים עד שאין ריח חריף יותר (לפחות שלוש פעמים). כלי זכוכית יבשים ומלקחיים בתנור (120 ° c). הפונקציונליות של עצה הערה: יש לבצע את כל הצעדים בתוך מכסה המנוע כדי להימנע משאיפת אדים אורגניים. בנוסף, נדרשים כפפות, מעיל מעבדה והגנת עיניים. משתמשים בניטריל או בכפפות גומי לכל צעד כדי למנוע זיהום. ללבוש כפפות עמידים ממס בעת שימוש toluene. כל השלבים, אם לא צוין אחרת, נעשים ב-RT. השתמש ציוד טרי וכפפות עבור כל צעד כדי למנוע החוצה זיהום אפשרי. לבצע הפעלת פני השטח על ידי החלת פלזמה חמצן שבב הזיז של AFM-ביו-DC.הערה: יעילות הטיפול בפלזמה לפונקציונליזציה של שלבים עם תוכן החמצן בתא הפלזמה. השתמש בפינצטה ניקוי טרי למקום שבבי הזיז AFM בחדר פלזמה (40 kHz, 600 W). השתמש בתוכנית הפעלה מותאמת אישית: פינוי (0.1 mbar) – הצפה עם חמצן ללחץ של: 0.2 mbar (4 דקות) – פלזמה תהליך (כוח: 40%, משך: 2 דקות, תהליך הלחץ: 0.2 mbar). לחדר ולהמשיך עם שלב 3.2.2 באופן מיידי על מנת למנוע כל ספיחה של מזהמים שבבים AFM מהאוויר. סילניזציה ופינגיציההערה: תזמון הוא פרמטר קריטי בין השלבים. הכינו פתרונות טריים ככל האפשר בזמן ההמתנה. קבוצות maleimide כפופים הידרוליזה בתקשורת מימית ו תיוולים בקלות להפוך תחמוצת כדי disulfides בפתרון33,47 לסכל הפונקציונליות של afm טיפ התגובות. הכינו פתרון silane-mal ב טולואן (1.25 mg/mL) בצינורות פלסטיק עמידים ממס או זכוכית ויוצקים 6 מ ל של הפתרון במנות פטרי שטוחות, 3 מ ל כל אחד.הערה: אם הכריכה של פולימרים בדיקה מרובים נצפתה בניסוי SMFS, ערבוב silane-פג-mal עם silane-יתד לא פונקציונלי יכול להפחית את מספר עיגון נקודות. להתאמת שכבת הפסיבציה פג עם מיסות שונות (כלומר, אורכי מתאר) ניתן להשתמש27. מודחת שבבי הזיז AFM מיד לאחר שלב 3.1.3 בפתרון silane-יתד-mal (עד 10 אסימונים לצלחת פטרי) עבור 3 h ב 60 ° c35. קחו את הצלחות פטרי מהתנור ותנו לפתרון להתקרר למשך 10 דקות לפחות. לשטוף כל שבב שלוחה AFM בזהירות. הפחת את ההשפעה של כוחות קפילר על הזיז של AFM כאשר עובר את ממשק האוויר, למשל על ידי הטיית שבבים אלה מעט כאשר משתשרים לתוך הפתרון. לפולימרים של פג ו-PS, יש לשטוף שלוש פעמים עם טולואן. עבור הפולימר הפסיפם, שטפו פעם אחת עם טולואן ופעמיים עם אתנול. לבחור לפחות שני שבבי זיז AFM כמו שליטה שבבי הזיז AFM, דילוג על שלב 3.3 ולשטוף אותם כדלקמן כדי להגדיל את קוטביות של ממס: עבור הפולימרים של פג ו PS, לשטוף פעמיים עם אתנול ופעם עם מים באולטרטהורים. . לשטוף פעמיים עם מים באולטרה-טהוריםהערה: שבבי שליטה AFM שבבים עברו את כל שלבי הפונקציונליזציה מלבד האביזר פולימר (שלב 3.3). הם משמשים כדי להוכיח את הניקיון של תהליך הפונקציונליות, מערכת המחזיק שבב ה-AFM, המשטחים והממיסים המשמשים לניסוי SMFS. אביזר פולימרי קוולנטיהערה: למרות שקצה הזיז של AFM צפוי להיות מכוסה לחלוטין בקבוצות מאלאימיד, יש רק מספר אתרים מחייבים עבור הפולימר הבודד היחיד, מכיוון שמאלאימיד עובר הידרוליזה במים המובילים ליתדות לא פעילים47. יתדות לא פעילים אלה פועלים כשכבת פסיבציה, כמתואר לעיל. מודטה AFM שבבי זיז ישירות לאחר שלב 3.2.5 באחד הפתרונות פולימר הבאים 3 מ ל מנות פטרי. אם פולימר בהתאמה אינו מומס כראוי, השתמש באמבט מים 40 ° c ומערבבים היטב את הפתרון.הערה: בעוד שהשימוש בפולימרים הופסקו תיול עשוי להוביל להיווצרות איגרות חוב דיסולניות המקצרת את התגובה עם קבוצות maleimide במיוחד אם שלב 3.3 מוחל במאגרים מימית עבור פולימרים מסיסים במים33. עבור הפולימרים של פג ו PS, להשתמש בריכוז של 1.25 mg/mL ב טולואן עבור 1 h ב 60 ° c. עבור פולימרים PNiPAM, להשתמש בריכוז של 1.25 mg/mL באתנול עבור 3 h ב RT.הערה: אם הכריכה של פולימרים בדיקה מרובים נצפתה בניסוי SMFS, ריכוז הפולימר צריך להיות מופחת. לשטוף בזהירות כל שבב הזיז AFM. עבור הפולימרים של פג ו PS, לשטוף פעמיים עם toluene, פעמיים עם אתנול ופעם עם מים באלקטרופורזה לאחר 10 דקות קריר למטה. עבור פולימרים PNiPAM, לשטוף פעמיים עם אתנול ופעמיים עם מים באולטרטהורים. אחסן כל שבב שלוחה של AFM בנפרד בצלחת פטרי קטנה (1 מ ל) המלאה במים באולטרסאונד ב-4 ° צ’ עד לשימוש בניסוי. 4. הכנה לפני השטח סיליקון אוקסיד וופלהערה: משטח זה שימש עבור SMFS עם פג ו PNiPAM. חותכים וופל תחמוצת סיליקון בחתיכות קטנות באמצעות סכין יהלום. לשים את חתיכות תחמוצת הסיליקון בנפרד צינורות מיקרוצנטריפוגה ולמלא את הצינורות האלה עם אתנול. Sonicate את חתיכות תחמוצת הסיליקון עבור 10 דקות. לשטוף את חתיכות תחמוצת הסיליקון עם אתנול פעמיים ולייבש אותם תחת זרימת חנקן בזהירות. השתמש בחתיכות תחמוצת הסיליקון באופן מיידי. מונאולייר מורכב הידרופובי אלקאן תיול על זהב (SAM)הערה: משטח זה שימש ל-SMFS עם PS. ראו ספרות39,49 למידע נוסף על סאמס. השתמש בציפוי סיליקון מצופה זהב (A [100], 5 טיטניום ננומטר, 100 זהב nm) כדי לבצע שלבים 4.1.1 – 4.1.4. מודב את חתיכות פני השטח בפתרון 1-dodecanthiol (2 מ”מ) עבור 18 h. שטפו את הסאמס הטרי המוכן באתנול פעמיים. סאמס יבש עם זרימת חנקן לשימוש ישיר או לאחסן אותם באתנול עד 4 ימים לשימוש מאוחר יותר. 5. רכישת נתונים הערה: כל המדידות המוצגות כאן בוצעו במים באולטרה-טהורות עם סייפר ES AFM תוך שימוש בשלב לדוגמה של חימום וקירור לשינויי טמפרטורה. באופן כללי, כל AFMs לספק את היכולת למדוד נוזלים ניתן להשתמש. הכנס את שבב ה-AFM הפונקציונליזציה לתוך ה-AFM. הדבק את המשטח המוכן לתוך מחזיק מדגם המתאים למדידת נוזלים (g., ברזולוציה גבוהה משכפל מתחם 101 RF או דבק UV לריפוי).הערה: סוכני מליטה אלה הם מאוד פעילים ועמידים למספר רב של ממיסים קוטביים. ההתנגדות של דבק ממיסים לא קוטבי (למשל, טולואן או הקסאן) או טמפרטורות גבוהות יש לבדוק לפני השימוש. הישאב את שבב ה-AFM של המכשיר ואת דגימת המקדח בנוזל, כאן: מים באולטרטהורים.הערה: ירידה ממס (כ 100 μL) ניתן להפקיד על מחזיק שבב ה-AFM של הזיז. כיסוי שבב ה-AFM עם הממס מפחית כוחות קפילר, אשר אחרת לפעול על הזיז AFM כאשר מתקרבים משטח המדגם עובר דרך ממשק האוויר מומס. במקרה הצורך, התאימו את הטמפרטורה ותנו למערכת להיות מעורפלת.הערה: שינויי הטמפרטורה עלולים לגרום לסטיה של הזיז של AFM עקב אפקט מתכתי עבור מנופים של AFM עם ציפוי רפלקטיבי כמו אלומיניום או זהב. יש לבצע את השפה הרחוקה מפני השטח (מספר μm) עד ששינוי נוסף של אות הטיה נצפה (עד 15 דקות עבור MLCT-Bio-DC). לשנות את הטמפרטורה באופן אקראי כדי להוציא את כל ההשפעות של הזדקנות הפונקציונליזציה. ודא שהטמפרטורות המוחלות אינן מובילות לכיפוף בלתי הפיך של הזיז ה-AFM.הערה: כל אפקטי הטמפרטורה על מאפייני הממס (כגון אידוי או שינויים בצמיגות) עלולים לעכב את הניסויים שלך. בדוגמאות המוצגות, הטמפרטורה היתה מגוונת על פני מגוון של עד 40 K בשלבים של 10 K נטילת מים כממס (למשל, מ 278 K כדי 318 K). גש אל פני השטח כדי לקבוע את האינולים (רגישות הפוך אופטית) על ידי נטילת עקומות כוח מאריך על משטח קשה (כגון תחמוצת הסיליקון). בשביל זה, לקחת את האות הסטה של הפוטוגלאי (ב V) לעומת מרחק piezo ולקבוע את השיפוע של החלק המייצג את הכניסה של קצה הזיז AFM לתוך המשטח הבסיסי (משטר דוחה) באמצעות פונקציה קווית. כדי להפחית שגיאות, קח את הממוצע של חמישה ערכים לפחות כדי לקבל את הערך הסופי של האינולים. לפרטים נוספים ראו בספרות4,39.הערה: ניתן לקבוע את האיניוולים רק באופן אמין על משטחים קשים. במקרה של ניסויים על משטחים רכים או ממשקים לוודא שאתה מקום משטח קשה קרוב משטחים רכים שלך. לאחר מכן, ניתן לבצע את כיול האינאוולים לפני או אחרי הניסויים במשטח הרך ללא צורך בפירוק ההתקנה של AFM. לקביעת קבוע באביב, להעביר את הזיז את ה-AFM לגובה עם אינטראקציות לא מושכות או מזיקות בין קצה הזיז של AFM ומשטח (מספר μm). לאחר מכן, להקליט את הספקטרום רעש תרמי שבו צפיפות הכוח ספקטרלי (PSD) לעומת תדירות מותווים. השלבים הבאים מתבצעים בדרך כלל על ידי פונקציות מובנות אוטומטיות בתוכנת AFM מסחרי: הראשון, הספקטרום התרמי שנרכש הרעש מנותח על ידי התאמת פונקציה PSD, למשל, מתנד הרמוני פשוט (שו). ההתאמה נעשית עד המינימום בין התהודה הראשונה לשנייה. שנית, האזור שמתחת לחלק הכולל של העלילה התדר PSD vs נקבע לייצג את העקירה המרובעת הממוצע של הזיז AFM בכיוון אנכי. לבסוף, משפט שווה משמש כדי להשיג את כוח הזיז של afm קבוע28,50.הערה: יש להשתמש בטווח תדרים מתאים המורכב מפסגת התהודה הראשונה של הזיז ה-AFM. כדי לקבל יחס משביע רצון של אות לרעש, יש לצבור לפחות 10 PSDs עם רזולוציית התדר הגבוהה ביותר האפשרית. . תתחיל את הניסוי מפות כוח הרשומה על ידי נטילת עקומות כוח הארכה בצורה כמו רשת (למשל, 10 x 10 נקודות עבור שטח של 20 x 20 יקרומטר2) כדי למנוע כל השפעות פני השטח המקומי (למשל, זיהומים, dislocations) ו ממוצע אזורי משטח שונים.הערה: פרמטרים אופייניים הם מהירות משיכה של 1 μm/s ושיעור דגימה של 5 kHz כדי להבטיח רזולוציה מספקת. קצב הדגימה צריך להיות מותאם כאשר מהירות המשיכה מגוונת. יש להתאים את מרחק הביטול למתאר או לאורך הספיחה של הפולימר הנמדד (כפליים מהאורך הצפוי). להשתמש ולשנות את הזמן לשכון לעבר פני השטח כדי לאפשר פולימר אחד לדבוק המשטח (בדרך כלל 0-5 s). חזרו על הנחישות של האינולים וקבוע האביב בסוף הניסוי כדי לבדוק את העקביות ואת יציבות המערכת.הערה: לצורך הדבקה חזקה בין פולימר למשטח, ניתן לבצע את הכיול לאחר הניסוי בפועל כדי לשמר את הפונקציונליזציה. 6. הערכת נתונים הערה: להערכת נתונים, תוכנה כתובה מותאמת אישית המבוססת על איגור פרו שימש לביצוע השלבים הבאים. המר את אות הסטה הגולמית (בולטים) לערכי הכוח (בניוטונים) באמצעות כפל עם האיננוולים הנרשמים וקבוע האביב הנחוש. הפחת את הסטיה של הזיז ה-AFM (לאחר הכפל של אות הסטה הגולמי עם האינאוולים) ממרחק המונע על-ידי רכיבי piezo בכיוון אנכי כדי להשיג את השלוחה האמיתית (מרחק קצה-המשטח)4. תיקון עקומות כוח-מאריך שהתקבלו לצורך הסחף על-ידי התאמת פונקציה קווית לתוכנית הבסיסית לאחר האירוע האחרון וחיסור זהה מעקומת כוח ההארכה. החלק הכולל צריך לייצג הארכה מספקת מפני השטח שבו לא האינטראקציות אטרקטיבי או דוחה לא נצפו בין קצה הזיז AFM ומשטח הבסיס. לאחר מכן, קו הבסיס מוגדר לציר האפס.הערה: במקרה של מדידות על משטחים רפלקטיבית כמו זהב, הפרעות עשויות להופיע. התוצאה היא השתקפות חלקית של קרן הלייזר מפני השטח ומאחור של הזיז של AFM. כך, עקומות כוח מאריכים שהתקבלו עשוי להראות sinusoidal כוח האות לאורך השלוחה האנכית. זהו חפץ שסלים. את ערכי הכוח הסופיים כדי להמשיך ולקחת את העיקולים הללו בכוח ההארכה, ניתןלפתור תיקון (איור 2). אם הפרעות מופיעות בעקומות כוח-הארכה, לבחור עקומת הרחבת כוח מייצג (עקומת הנסיגה) מראה שום אירועים אחרים מאשר אולי שיא של הדבקה לא ספציפית ואת אותו sinusoidal החפץ (כלומר, משרעת ופאזה) (איור 2א).הערה: החלק את עקומת הכוח המייצג של התוסף כדי לקבל את תבנית התדר הנמוך של ההפרעה. בחר עקומת כוח הרחבה שיש לתקן (איור 2ב). שכבת-על הן עקומות של הרחבת כוח משלבים 6.4. ו-6.5. כדי לוודא ששניהם מראים את אותו חפץ sinusoidal (כלומר, משרעת ופאזה) (איור 2ג). הפחת את העקומה (המוחלק) של עקומת ההרחבה מתוך עקומת הרחבת הכוח לתיקון המוביל לישר ולא לבסיס sinusoidal (איור 2ד).הערה: שימו לב שפסגת ההדבקה הבלתי ספציפית של עקומת הנציגים נבדל מכל אירועי מולקולה בודדים המופיעים בעקומות שיתוקנו. למעשה, הבחירה של עקומת הנציג היא חיונית לתיקון תקין.

Representative Results

הדוגמאות הבאות מציגות תוצאות של מולקולה יחידה מתיחה והדסורזיה של פולימרים פג, PNiPAM ו PS. כל הטיפים הקשורים ל-AFM הינם פונקציונלי עם הפרוטוקול שניתן לעיל. פג ו PNiPAM נמדדו ב-SiOx עם וריאציה טמפרטורה. לדיון מפורט של עקומות מתיחה תלויות וכתוצאה מכך עבור יתד ו pnipam, לראות kolberg ואח ’18 מוטיב כוח שונה שלוחה היא רמה של כוח קבוע (למשל, כאשר desorbing PS ממונאולאיירס התאספו עצמית של מתיל הופסק אלקאן תיולים על זהב (SAM) במים4,27,39,51) דוגמה 1: מתיחה של יתד ו PNiPAM במיםטמפרטורה תלוי התנהגות מתיחה במים נמדד באמצעות PNiPAM בודד ו-יתד פולימרים מאוגד לקצה הזיז AFM בקצה אחד הפיסיופיזיולוגיה על פני השטח SiOx בקצה השני. לאחר הכיול וניסויים בקרת נקי (פחות מ 2% של עקומות כוח-הארכה להראות אירועים מולקולה אחת), לפחות שתי מפות כוח נרשמו עבור כל זיז AFM. הניסוי התלוי בטמפרטורה בוצע על ידי הקלטת לפחות מפת כוח אחת בכל טמפרטורה. כאשר רק אירועים מתיחה מעטים הופיעו, שלוחה AFM בהתאמה נמחק ושלוחה AFM הבאה של השבב נלקח (בדרך כלל בסדר C, B, D ו-E של MLCT-ביו-DC). עבור הנתונים למופת של פג, אירוע מתיחה אחת נצפתה 95 מתוך 500 מנמדד כוח עקומות הארכה (19%). עבור PNiPAM, 252 מתוך 600 כוח הארכת עקומות הראה דפוס מתיחה (42%). להשוואה טובה יותר של עקומות כוח-הארכה, עקומת אב יחיד עבור כל טמפרטורה נוצר. למטרה זו, רק אלה עקומות עם אירוע מתיחה לפחות 500 pN, שם קונפורמציה תנודות ואפקטים ממס הם זניחים, נבחרו52. המספר הסופי של מתיחות נלקח בחשבון היה 3 ב 278 K, 7 ב 298 K ו 4 ב 318 K עבור פג ו 4 ב 278 K, 3 ב 298 k ו 3 ב 318 K עבור PNiPAM18. ההליך ליצירת עקומות בסיס מוענק באיור 3. עקומות כוח הארכה שנבחרו (איור 3A) הם מחדש לאורך L0 (סיומת בכוח של 500 pN), ראה איור 3ב. שיא הדבקה מראה וריאציה גדולה של הדבקה לא ספציפית בין המשטח לבין קצה הזיז AFM, אך אינו משפיע על התנהגות מתיחה פולימר. לאחר המיזוג של עקומות הרחבת הכוח המושנות מחדש, הן מאוגות על-ידי החלקה בינאומרית כפי שהוצגה באיור 3ג. בשביל זה, מסנן גאוסיאני מחבר את הנתונים עם מקדמים מנורמל שמקורם במשולש של פסקל ברמה שווה לפרמטר ההחלקה 2053. לבסוף, עקומת מאסטר מושגת עבור כל טמפרטורה כפי שניתן באיור 3D. הזום מציג את הטווח שבו אפקט הטמפרטורה בהתנהגות הרחבת הכוח מבוטא ביותר. השוואה של התנהגות הטמפרטורה של פג (A) ו PNiPAM (ב) ניתן למצוא באיור 4. עבור יתד ירידה של כוח מתיחה עם הטמפרטורה הגוברת נצפתה. גידול של כ 5% הארכה מחדש ב 100 pN נצפתה בעת הגדלת הטמפרטורה מ 278 אל 318 K. עבור PNiPAM, משמרת מנוגדת לטמפרטורה תלויה יכול להתגלות. ירידה של כ 1% של הארכה בקנה מידה של 100 pN נצפתה כאשר הטמפרטורה הוגדלה מ 278 ל 328 K. בנוסף, אנרגיה מתיחה חופשית ניתן להשיג מן עקומות כוח הארכת מאסטר על ידי קביעת האזור תחת העקומה עבור כל ערך כוח נתון. ניתן להשתמש באפשרות זו להפקת תרומות אנרגטיות ואנמיות של אנרגיה חופשית מתיחה בעזרת דינמיקה מולקולרית (MD) סימולציות18. דוגמה 2: הדיסורזיה של PS ממשטח סם במיםהספיחה של PS מ-משטח SAM במים ניתן להשתמש כדי לקבוע את הכוח והאורך הדסורבי ובכך לכמת את האינטראקציה ההידרופובי. לאחר הכיול, לפחות שתי מפות כוח נרשמו בשני כתמים שונים של פני השטח. כאשר הקובץ המצורף פולימר הצליח, עקומות כוח מאריך הראה מישורים של כוח מתמיד, כמו תכונה אופיינית, ראה איור 5A ו- איור 5ג. כאשר הדינמיקה של איגרות החוב הנחקר מהירה הרבה יותר מקצב המשיכה של קצה הזיז המדומה AFM (שיווי משקל). כוחות desorption כמו מאריך כוח הארכת עקומות ישירות לספק אנרגיות ללא הדבקה על ידי שילוב כוח הארכה מעקב54. הם שימשו כדי לקבוע אינטראקציות אלקטרוסטטית, מפזרים והידרופובי, כמו גם מאפייני חיכוך של פולימרים יחיד על משטחים בסביבה נוזלית2,4,23,51,54,55. כל רמה של כוח קבוע היה מצויד בעיקול הסיגולי כדי לקבוע את כוח הדסורזיה ואת אורך desorption אשר לאחר מכן הותוו ב היסטגרמות. ההיסטגרמות הותאמו באמצעות גאוס כדי לחלץ את הערך המירבי ואת סטיית התקן. לקבלת סקירה טובה יותר, ערכי העוצמה והאורך של הפונקציה מוצגים יחד בתוך מגרש פיזור, כפי שניתן באיור 5ב ואיור 5ד. לפוליסטירן על סם במים, כוחות הביטחון הנחושים מקבילים לערכים המתקבלים בעבר19,23. כמו אורך desorption התואם את אורך מתאר פולימרים51, התפלגות האורך desorption ניתן להשתמש כהוכחה של הכריכה הקוולנטי של פולימר בהתאמה לקצה הזיז afm באמצעות הקבוצה הפונקציונלית שלה לסיים. לפיכך, אורך הספיחה משמש כטביעת אצבע. עבור יותר פולימר אחד מוצמד קצה הזיז AFM, מפלי מישורים (שלבים בדידים) ניתן להבחין בעקומות כוח מאריך56. כל רמה מייצגת את הספיחה של פולימר בשלוחה שונה. הניסוי שניתן באיור 5ג ואיור 5D הראו מקרה אופייני של שני פולימרים המחוברים לקצה הזיז afm באותו זמן. על-ידי התאמת הקרע הסופי, ניתן למצוא התפלגות דו-מודאלית עבור אורך הספיחה, בעוד שכוח הספיחה הראה התפלגות צרה. במקרה זה, את האורך הקטן ביותר ניתן למצוא ב 90% של עקומות כוח מאריך, או כרמה אחת או כרמה נוספת במישור הארוך יותר, כפי שניתן באיור 5ג. אורך הדסורזיה גבוה יותר נמצא ב-37% מהעקומות המתקבלות מהארכת כוח. לפיכך, ניתן להשתמש בהתפלגות באורך הקצר כדי לקבוע את מספר הפולימרים השונים המחוברים לקצה הזיז AFM. באופן כללי, התפלגות צרה של ערכי האורך הקצר הוא אינדיקציה טובה כי אחד ואותו פולימר בודד נחקר בעקומות כוח מאריך השיגה. במקביל, ניתן להשתמש במיקום הסופרפוזיציה של השלוחה המתאימה, כדי להחליט האם אחד מהפולימר היחיד נמדד. לאחר הוכחת מחייב קוולנטי של מפולימר יחיד PS, ניסויים נוספים עם זה מפולימר PS ניתן לבצע מצע משתנה (משטח מלא, כמו גם סרטים פולימריים), תנאי ממס, טמפרטורה, משיכת מהירות או לשכון זמן. איור 1: מבט סכימטי של תהליך הפונקציונליות של העצה. כולל את השינוי הכימי של קצה הזיז AFM לאחר (1) פלזמה הפעלה (2) silanization/הפיציה ו (3) החזקה פולימר. בנוסף, מבנים כימיים מפורטים של פולימרים המשמשים, כלומר פג, PNiPAM ו-PS מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: חיסול הפרעות בעקומות כוח-הארכה. (א) למצוא את עקומת כוח מאריך מראה sinusoidal כוח האות לאורך השלוחה אבל ללא מולקולה יחידה מתיחה אירוע. (ב) לבחור עקומת כוח הארכה עם אירוע מולקולה אחת, אשר תוקנה מן החפץ sinusoidal. (ג) להטיל על העקומות כדי לשלוט אם הממצאים הsinusoidal של עקומות באמת להתאים. (ד) על-ידי חיסור עקומת הרחבת הכוח (A) מ (ב) עקומת כוח-הארכה עם קו בסיס ישר מושגת. למרות השיא הדבקה לא יכול לשמש ניתוח נוסף, עקומת כוח הארכה מתוקנת כעת עבור החפץ המוביל ערכי כוח מדויקים הרבה יותר באזור של אירוע המולקולה היחידה (כאן: > 0.2 יקרומטר של סיומת). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: קביעת עקומות בסיס מן הארכת כוח עקומות של פג ב 298 K. (א) מידע ניסיוני ב-298 K, באמצעות 7 עקומות כוח מאריך. לאחר שינוי קנה מידה לאורך L0 בכוח של 500 pN (ב), עקומות כוח-הארכה ניתן למזג וממוצעים על ידי החלקה binominal השגת עקומת הראשי (C). העקומות הניתנות לשינוי קנה מידה מוצגות כנקודות כאשר עקומת הבסיס מוצגת כקו מלא. לבסוף, את עקומות המאסטר שהושגו עבור טמפרטורות שונות ניתן להשוות (D). הזום מציין את הטווח שבו אפקט הטמפרטורה בהתנהגות הרחבת הכוח מבוטא ביותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: השוואה בין עקומות המאסטר תלויי הטמפרטורה של PNiPAM ו-פג. עבור פג עלייה של הארכה מחדש ב 100 pN (באמצעכוח טווח) הוא נצפתה בעת הגדלת הטמפרטורה (א), ואילו עבור PNiPAM הפוכה הטמפרטורה תלוי המעבר נחשף (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: ניתוח עקומות כוח מאריך של PS על SAM במים. (א) הרחבת כוח המופת (כחול) עם התאמה מרבית של המישור (הארגמן). בנוסף, החיצים לסמן את הכוח הנחוש (אדום) ואורך (ירוק) של המישור. הכוח הדסורבי וערכי האורך הנתונים המתקבלים בהתאם לערכים מוצגים בהתוויה של פיזור וכתוצאה מכך היסטורגרמות שהתקבלו מצוידים בגאוסיאנית. (ב) הממוצע הנחוש של כוח הדסורזיה וערכי אורך הדסורזיה הם (112 ± 6) pN ו (659 ± 7) nm, שבו 93% של עקומות כוח מאריך להראות כזה אירועים ברמה אחת. (ג) עיקול כוח מופתי (כחול) לשני פולימרים המחוברים לקצה הזיז afm באותו זמן. כאן, הכוח desorption מראה התפלגות unimodal עם ערך כוח ממוצע של (117 ± 5) pN, בעוד התפלגות דו-אופנית ניתן למצוא עבור האורך desorption המוביל ערכי אורך ממוצע של (656 ± 9) nm ו (1050 ± 16) nm. (ד) 90% מהעיקולים של הרחבת הכוח שנדגמו מציגים רק אירועי רמה בודדים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

SMFS מבוססי AFM הוא אחד הכלים העיקריים לחקירת אינטראקציות מולקולה אחת בפיסיקה פולימר. עבור ניסוי מולקולה בודדת אמיתית, המצורף הקוולנטי של פולימר המקדח לקצה הזיז AFM הוא חיוני.

עבודות קודמות רבות מבוססות על ניסויים ננו דיג, במיוחד עבור pnipam, איפה פולימרים הם נספחת על פני השטח ולאחר מכן נמתח על ידי בחירת אקראי מתוך המצע באמצעות קצה שלוחה afm30,31. הדבר עשוי לשנות את התוצאות ולהוביל לפענוח שגוי של התנהגות המולקולה הבודדת. שם, השפעות שיתופיות עשויים להשתלט על התוצאות משום שאינטראקציות עם פולימרים שכנים לא ניתן לכלול. זה יש השפעה גדולה על התוצאות, במיוחד עבור פולימרים להראות התנהגות שונה באופן משמעותי בכמויות גדולות לעומת מולקולות בודדות57,58.

פרוטוקול הפונקציונליזציה המוצג כאן הוא אמין וניתן להחילו בקלות על פולימרים שונים, ללא קשר לאורך המתאר שלהם, הידרופוביניטי או הפרעה הסטרומית של המונמרים. בנוסף, מסופק פסיבציה למניעת אינטראקציות לא רצויות בין הפולימר היחיד לבין קצה הזיז של AFM, כמו גם בין קצה הזיז של AFM לבין משטח הבסיס. יתר על כן, הערכה של עקומות כוח הארכה מראה אירועים מתיחה מוצג. שם, מוצע הליך לקביעת עקומות כוח מאסטר. זה מציע דרך טובה יותר לחשוף, למשל, השפעות טמפרטורה הקשורות בהתנהגות הארכת כוח. יתר על כן, ניתוח של מולקולה אחת desorption אירועים שמציעות מישורים כוח קבוע מסופק. גם, דרך פשוטה של תיקון ממצאים sinusoidal force אותות בעקומות כוח מאריך ניתנת אשר עלולה לפגוע אחרת בתוצאות של הניסוי.

בהשוואה לשטטר ואח ‘39, הליך הפונקציונליזציה המוצג כאן מצטמצם לשלושה שלבים במקום ארבע והחוסן של השגרה משופר. היתרון העיקרי של ביצוע הפינגיציה והסילניזציה בשלב אחד הוא לקבל תגובה מבוקרת יותר ולהגדיל את התשואה. יתר על כן, פתרונות פחות צריך להיות מוכנים שלבי שטיפה פחות נדרשים. פעולה זו מקטינה את המאמץ והזמן להכנה ומגבירה את היכולת הנוזלה. יתר על כן, העברת מנופים AFM תמיד הוא חלק קריטי של תהליך הפונקציונליזציה. העברה מפתרון אחד לשני תמיד מפעיל את הסיכון להשפיע מאוד על איכות הפונקציונליות בשל העברות באמצעות ממשק מים אוויר או לאבד AFM התלויה מנופים על ידי שימוש לא נאות של מלקחיים.

כדי להוכיח מצורף המתאים ביותר של פולימר אחד לקצה הזיז AFM התנאים השונים צריך להיות מתקיים. ראשית, השליטה מנוף AFM הם בעלי חשיבות משמעותית ויש להכין עבור כל הפונקציונליזציה. תהליך הפונקציונליזציה והתא הנוזלי לביצוע הניסויים נחשבים לנקיים בלבד, אם מספר קטן של עקומות כוח-מאריך מראים מתיחות או מישורים בניסוי השליטה (בדוגמאות המוצגות פחות מ -2%).

דפוס מתיחה ברורה ללא טיפות נוספות או מקסימה היא חיונית עבור מולקולה אחת נאותה מתיחה אירועים. בנוסף, התלות של כוח הקרע על שיעור טעינת כוח בקרע או תגובה גמישה מלאה של עקומת מתיחה צריך להיות מנותח על מנת להוציא בו desorption של פולימרים מרובים59,60. עבור יתד ו PNiPAM, 19% ו 42% של עקומות כוח הארכה שנלקחו במיקומים שונים של פני השטח הראו דפוס כזה מתיחה, בהתאמה. על מנת להשיג אירועים מתיחה, הפיזיסורזיה של הפולימר למשטח המתאים בבסיס חייב להיות חזק. אחרת, אירוע הדסורזיה הדומה לרמת הרמה הוא נצפה. זה אפילו יותר מכריע לזיהוי אירועי מתיחה בכוחות הגבוהים (עד 500 pN או יותר). כאשר הפיסיוספיחה החזקה הזאת לא מתקיים עבור כל עקומת כוח הארכה, התשואה של אירועים כאלה היא פחות מאשר לאירועים ברמה הטהורה כמו מישור. כחלופה, שמירה מאוד על קבוצות כגון catechols או כימוזיה בין משטח פולימרי לבין הבסיס ניתן להשתמש. עם זאת, זה דורש הקדמה של קבוצות פונקציונליות נוספת או אתרים מצמד ב פולימר61,62.

למעשה, המסה (כלומר, אורך המתאר) של הפולימר מספק טביעת אצבע רבת ערך. למרות שהמסה אינה יכולה להיות מתורגמת ישירות לאורך המתאר הנמדד מהסיבות הבאות, התפלגות האורך היא בעלת ערך רב להגדרת אירועי מולקולה בודדת. במקרה של פולימר PNiPAM עם פולידיסטיטיות נמוך (Ɖ = 1.28), מצאנו הבדלים משמעותיים בערכי ההרחבה עבור אירועי מתיחה שהושג (ובכך אורך הפולימר) בניסויים. סיבה אחת לכך יכולה להיות הנחישות של אורך הפולימר ואת ההתפלגות שלה. ב-size-הדרה כרומטוגרפיה (SEC), משקל יחסי של פולימר היעד נקבע בהשוואה עם תקנים כמו PS או פולי (מתיל מלית) (PMMA)63. המשקל היחסי המשוער צפוי לסטות מהמשקל המולקולרי המוחלט משום שרדיוס ההידרודינמי של פולימר היעד והתקן יכול להיות שונה באופן משמעותי. בנוסף, שכבת silane עשוי להיות oligomerized על ידי מים מלאכותי בטולואן במהלך תהליך הפונקציונליזציה. ההחזקה של oligomers כזה לקצה הזיז AFM מוביל שכבה גמישה יותר עם פחות נקודות עוגן64. כמו כן, נקודת ההחזקה של הפולימר לשכבת הסיליקון עשוי לא בהכרח להיות בפיסגה המובילה למעבר של ערכי אורך שאותרו29. בעוד מודל פולימרי כגון שרשרת התולעת כמו (wlc) או שרשרת גמיש בחופשיות (fjc) לא יכול לשכפל את התנהגות בהתאמה כוח הארכה עבור יתד או pnipam כראוי על טווח ההרחבה כולו18,29,41,65,66,,,כגון מודל פולימרי עשוי להיות בעל ערךעבור מערכותפולימרים וחלבונים אחרים686710

החיבור הקוולנטי של אחד מפולימר PS יחיד (עם אורך מתאר של יותר מ-1 μm) נחשב למוצלח בלבד, כאשר מספר ניכר של עקומות כוח-הארכה מראה רמה ארוכה של כוח מתמיד (איור 5). מישור הנובע מחוסר בינג פולימר בודד מוגדר על ידי טיפה חדה בודדת של כוח קבוע לקו הבסיס בשלוחה מסוימת, כפי שניתן באיור 5א. אם יותר פולימרים מחוברים לקצה הזיז AFM, מפל של מישורים נצפתה56 (איור 5ג). אורך הרמה (אורך desorption), הקשורים עם אורך מתאר פולימר51, יש להיות משמעותית יותר זמן מאשר כל שיא הדבקה עקב הדבקה ספציפית של afm הקצה למשטח הבסיס (כאן סביב 200 ננומטר). תכונות המופיעות אך ורק בעקומת הארכה של כוח אחת, לא אמורות להתפרש. בניסויים שהוצגו, לפחות 80 מתוך 100 עקומות הראו רמה ארוכה יותר מאשר 200 nm ב לפחות שני מפות כוח בשני כתמים שונים על פני השטח. יתר על כן, התפלגות של אורכי הספיחה, באמצעות מגרשים פיזור כגון נתון באיור 5B ו -5d, לגלות אם וכמה פולימרים רבים מאוגדים קצה הזיז afm. במקרה של נ. ב., התפלגות צרה של כוח הדסורזיה ואורך הנלקח מרמות עקומות של הארכת כוח שימשו כהוכחה להחזקה מוצלחת של הקשר הקוולנטי. הדבר הוכיח בסופו של דבר את ההצלחה של פרוטוקול הפונקציונליזציה. לכן, אנו ממליצים בחום להציג הפצות כאלה של כוח ואורך בפרסומים.

הערכת עקומות כוח-מאריך באמצעות אלגוריתמים מוכללים המרכיבים מספר רב של פרמטרים שנקבעו מראש צריכים להתבצע בזהירות. הסיבות הן לדוגמה שקצב דגימה קבוע אינו מתאים לכל מהירות משיכה שהוחלה או שהחלקת אוטומטית של עקומות הרחבת הכוח עשויה להיות ממוצעת של פרטים חשובים. בדרך כלל הבנה נכונה של הליך ההערכה המתאים יכול למנוע שגיאות בהליך ההערכה, אשר יכול בתורו מאוד להשפיע על הממצאים הסופיים של הניסוי SMFS מבוסס AFM.

לסיכום, אנו מציגים פרוטוקול פונקציונליזציה שהוא אמין וניתן להחילו בקלות על מגוון פולימרים. יתר על כן, הערכה נאותה של עקומות יחיד מולקולה כוח מאריך מוצג, המאפשר קביעת פרמטרים פיזיים כגון כוח מתיחה, כוח desorption ואורך desorption. הפרוטוקולים והנהלים המוצגים הם בעלי ערך לחקירת מערכות תגובה לגירויים ברמת המולקולה הבודדת.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

B.N.B. ו-T.H. מימון המימון של הגרמני הפורשיגומיימיתושיסםדרך (DFG, קרן המחקר הגרמנית) תחת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה – EXC-2193/1 – 390951807, gefördert durch למות הגרמני הבינלאומי (DFG) im האדם הטוב ביותר דה בוננדס ו דר ללאנדר – EXC-2193/1 – 390951807, ו גרנט HU 997/1-13 (פרויקט 420798410). מ מכירה בתמיכה חלקית במסגרת פרויקט ה-“לואי” ב-Apo, על ידי משרד החינוך הגבוה של הסן, מחקר ואמנויות. אנו מודים ד ר וולפגנג ברונר וד ר. ‘. זוקאוסקריט ממכון פראונהופר ליישומי חיל-אוויר מוצק המדינה לתרומת מוצרי סיליקון באיכות גבוהה מצופה זהב.

Materials

1-Dodecanethiol (≥98%) Sigma-Aldrich, USA 417364-500ML Used for SAM
Ammonia solution (30%) Roth, Germany CP17.2 Used for cleaning
Cypher ES Asylum Research, an Oxford Instruments company, USA – AFM
Ethanol (≥99.9%) Roth, Germany PO76.1 Solvent
Gold coated silicon wafer Fraunhofer Institute for Applied Solid State Physics IAF, Germany – Used for SAM
High Resolution Replicating Compound Microset Products Ltd, UK 101RF Bonding agent
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich, USA H1009 Used for cleaning
Igor Pro Wavemetrics, USA – Software environment
Tetra-30-LF-PC Diener Electronic, Germany – Plasma chamber
Maleimide-polyethylene glycol-triethoxysilane Creative PEG works, USA PHB-1923 Linker polymer
MLCT-Bio-DC Bruker, USA MLCT-Bio-DC AFM cantilever
Prime CZ-Si wafer, n-type (Phosphor) TTV < 10 µm MicroChemicals, Germany WSA40600250 P1314SNN1 Silicon wafer
Purelab Chorus 1, 18.2 MΩ cm Elga LabWater, Germany 10034-540 Ultrapure water source
R3 SA Vomm GmbH, Germany 5803 Blank Tweezers
Thiol terminated poly(N-isopropylacrylamide) Gallei Group, Saarland University, Germany – PNiPAM probe polymer
Thiol terminated polystyrene Polymer Source, Canada P40722-SSH PS probe polymer
Thiol-polyethylene glycol-thiol Creative PEGWorks, USA PSB-615 PEG probe polymer
Toluene (99.99%) Fisher Chemicals T324-500 Solvent
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56 (9), 930-933 (1986).
  2. Hugel, T., Seitz, M. The Study of Molecular Interactions by AFM Force Spectroscopy. Macromolecular Rapid Communications. 22 (13), 989-1016 (2001).
  3. Butt, H. -. J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1 (2005).
  4. Balzer, B. N., Hugel, T., Hashmi, S. Single-Molecule Detection and Manipulation. Reference Module in Materials Science and Materials Engineering. , (2016).
  5. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  6. Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. -. A., Perkins, T. T. Force Spectroscopy with 9-μs Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry. Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).
  7. Alsteens, D., et al. Nanomechanical mapping of first binding steps of a virus to animal cells. Nature Nanotechnology. 12 (2), 177-183 (2017).
  8. Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468, 72-76 (2010).
  9. Shibata, M., et al. Real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 visualized by high-speed atomic force microscopy. Nature Communications. 8 (1), 1-9 (2017).
  10. Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM. Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).
  11. Oesterhelt, F., Oesterhelt, D., Pfeiffer, M., Engel, A., Gaub, H. E., Müller, D. J. Unfolding pathways of individual bacteriorhodopsins. Science. 288 (5463), 143-146 (2000).
  12. Hugel, T., Holland, N. B., Cattani, A., Moroder, L., Seitz, M., Gaub, H. E. Single-molecule optomechanical cycle. Science. 296 (5570), 1103-1106 (2002).
  13. Yu, H., Siewny, M. G. W., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins. Science. 355 (6328), 945-950 (2017).
  14. Erlich, K. R., Sedlak, S. M., Jobst, M. A., Milles, L. F., Gaub, H. E. DNA-free directed assembly in single-molecule cut-and-paste. Nanoscale. 11 (2), 407-411 (2019).
  15. Rico, F., Russek, A., González, L., Grubmüller, H., Scheuring, S. Heterogeneous and rate-dependent streptavidin-biotin unbinding revealed by high-speed force spectroscopy and atomistic simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6594-6601 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Kienle, S., Liese, S., Schwierz, N., Netz, R. R., Hugel, T. The effect of temperature on single-polypeptide adsorption. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry. 13 (4), 982-989 (2012).
  18. Kolberg, A., et al. Opposing Temperature Dependence of the Stretching Response of Single PEG and PNiPAM Polymers. Journal of the American Chemical Society. 141 (29), 11603-11613 (2019).
  19. Balzer, B. N., et al. Cohesion Mechanisms of Polystyrene-Based Thin Polymer Films. Macromolecules. 46 (18), 7406-7414 (2013).
  20. Balzer, B. N., et al. Adhesion property profiles of supported thin polymer films. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (13), 6300-6306 (2013).
  21. Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
  22. Schwierz, N., Krysiak, S., Hugel, T., Zacharias, M. Mechanism of Reversible Peptide-Bilayer Attachment: Combined Simulation and Experimental Single-Molecule Study. Langmuir. 32 (3), 810-821 (2016).
  23. Balzer, B. N., et al. Nanoscale Friction Mechanisms at Solid-Liquid Interfaces. Angewandte Chemie International Edition. 52 (25), 6541-6544 (2013).
  24. Balzer, B. N., Kienle, S., Gallei, M., von Klitzing, R., Rehahn, M., Hugel, T. Stick-Slip Mechanisms at the Nanoscale. Soft Materials. 12, 106-114 (2014).
  25. Kühner, F., Erdmann, M., Sonnenberg, L., Serr, A., Morfill, J., Gaub, H. E. Friction of single polymers at surfaces. Langmuir. 22 (26), 11180-11186 (2006).
  26. Grebíková, L., Gojzewski, H., Kieviet, B. D., Klein Gunnewiek, M., Vancso, G. J. Pulling angle-dependent force microscopy. The Review of Scientific Instruments. 88 (3), 33705 (2017).
  27. Geisler, M., et al. Hydrophobic and Hofmeister effects on the adhesion of spider silk proteins onto solid substrates: an AFM-based single-molecule study. Langmuir. 24 (4), 1350-1355 (2008).
  28. Pirzer, T., Hugel, T. Atomic force microscopy spring constant determination in viscous liquids. Review of Scientific Instruments. 80 (3), 35110 (2009).
  29. Liese, S., et al. Hydration Effects Turn a Highly Stretched Polymer from an Entropic into an Energetic Spring. ACS Nano. 11 (1), 702-712 (2017).
  30. Cui, S., Pang, X., Zhang, S., Yu, Y., Ma, H., Zhang, X. Unexpected Temperature-Dependent Single Chain Mechanics of Poly(N-isopropyl-acrylamide) in Water. Langmuir. 28 (11), 5151-5157 (2012).
  31. Liang, X., Nakajima, K. Nanofishing of a Single Polymer Chain: Temperature-Induced Coil-Globule Transition of Poly(N -isopropylacrylamide) Chain in Water. Macromolecular Chemistry and Physics. 219 (3), 1700394 (2018).
  32. Zhang, W., Zou, S., Wang, C., Zhang, X. Single Polymer Chain Elongation of Poly(N -isopropylacrylamide) and Poly(acrylamide) by Atomic Force Microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (44), 10258-10264 (2000).
  33. Hermanson, G. T. . Bioconjugate techniques – 3rd Edition. , (2013).
  34. Leitner, M., et al. Single-molecule AFM characterization of individual chemically tagged DNA tetrahedra. ACS Nano. 5 (9), 7048-7054 (2011).
  35. Walder, R., et al. Rapid Characterization of a Mechanically Labile α-Helical Protein Enabled by Efficient Site-Specific Bioconjugation. Journal of the American Chemical Society. 139 (29), 9867-9875 (2017).
  36. Tang, J., et al. High-affinity tags fused to s-layer proteins probed by atomic force microscopy. Langmuir. 24 (4), 1324-1329 (2008).
  37. Wildling, L., et al. Linking of sensor molecules with amino groups to amino-functionalized AFM tips. Bioconjugate Chemistry. 22 (6), 1239-1248 (2011).
  38. Maity, S., Viazovkina, E., Gall, A., Lyubchenko, Y. A. A Metal-free Click Chemistry Approach for the Assembly and Probing of Biomolecules. Journal of Nature and Science. 2 (4), 187 (2016).
  39. Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (96), e52456 (2015).
  40. Becke, T. D., et al. Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58167 (2018).
  41. Ott, W., et al. Elastin-like Polypeptide Linkers for Single-Molecule Force Spectroscopy. ACS Nano. 11 (6), 6346-6354 (2017).
  42. Newton, R., et al. Combining confocal and atomic force microscopy to quantify single-virus binding to mammalian cell surfaces. Nature Protocols. 12 (11), 2275-2292 (2017).
  43. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Analytical Biochemistry. 156 (1), 220-222 (1986).
  44. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Analytical Biochemistry. 185 (1), 131-135 (1990).
  45. Baird, J. A., Olayo-Valles, R., Rinaldi, C., Taylor, L. S. Effect of Molecular Weight, Temperature, and Additives on the Moisture Sorption Properties of Polyethylene Glycol. Journal of Pharmaceutical Sciences. 99 (1), 154-168 (2010).
  46. Halperin, A., Kröger, M., Winnik, F. M. Poly(N-isopropylacrylamide) Phase Diagrams: Fifty Years of Research. Angewandte Chemie International Edition. 54 (51), 15342-15367 (2015).
  47. Barradas, R. G., Fletcher, S., Porter, J. D. The hydrolysis of maleimide in alkaline solution. Canadian Journal of Chemistry. 54 (9), 1400-1404 (1976).
  48. Kharasch, N., Tarbell, D. S. Chapter 10 – The Mechanism of Oxidation of Thiols to Disulfides. Organic Sulfur Compounds. , 97-102 (1961).
  49. Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1992).
  50. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868-1873 (1998).
  51. Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
  52. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H. E., Netz, R. R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 48301 (2005).
  53. Marchand, P., Marmet, L. Binomial smoothing filter: A way to avoid some pitfalls of least-squares polynomial smoothing. Review of Scientific Instruments. 54 (8), 1034-1041 (1983).
  54. Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2842-2847 (2008).
  55. Friedsam, C., Gaub, H. E., Netz, R. R. Adsorption energies of single charged polymers. EPL (Europhysics Letters). 72 (5), 844-850 (2005).
  56. Scherer, A., Zhou, C., Michaelis, J., Brauchle, C., Zumbusch, A. Intermolecular Interactions of Polymer Molecules Determined by Single-Molecule Force Spectroscopy. Macromolecules. 38 (23), 9821-9825 (2005).
  57. Abbott, L. J., Tucker, A. K., Stevens, M. J. Single Chain Structure of a Poly(N-isopropylacrylamide) Surfactant in Water. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (9), 3837-3845 (2015).
  58. Okano, T., Bae, Y. H., Jacobs, H., Kim, S. W. Thermally on-off switching polymers for drug permeation and release. Journal of Controlled Release. 11 (1), 255-265 (1990).
  59. Sulchek, T., Friddle, R. W., Noy, A. Strength of multiple parallel biological bonds. Biophysical journal. 90 (12), 4686-4691 (2006).
  60. Sulchek, T. A., et al. Dynamic force spectroscopy of parallel individual Mucin1-antibody bonds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16638-16643 (2005).
  61. Krysiak, S., Wei, Q., Rischka, K., Hartwig, A., Haag, R., Hugel, T. Adsorption mechanism and valency of catechol-functionalized hyperbranched polyglycerols. Beilstein Journal of Organic Chemistry. 11, 828-836 (2015).
  62. Jobst, M. A., Schoeler, C., Malinowska, K., Nash, M. A. Investigating receptor-ligand systems of the cellulosome with AFM-based single-molecule force spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (82), e50950 (2013).
  63. Trathnigg, B. Determination of MWD and chemical composition of polymers by chromatographic techniques. Progress in Polymer Science. 20 (4), 615-650 (1995).
  64. Blass, J., Albrecht, M., Wenz, G., Zang, Y. N., Bennewitz, R. Single-molecule force spectroscopy of fast reversible bonds. Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (7), 5239-5245 (2017).
  65. Oesterhelt, F., Rief, M., Gaub, H. E. Single molecule force spectroscopy by AFM indicates helical structure of poly(ethylene-glycol) in water. New Journal of Physics. 1, 1-11 (1999).
  66. Xue, Y., Li, X., Li, H., Zhang, W. Quantifying thiol-gold interactions towards the efficient strength control. Nature Communications. 5, 4348 (2014).
  67. Lyu, X., Song, Y., Feng, W., Zhang, W. Direct Observation of Single-Molecule Stick-Slip Motion in Polyamide Single Crystals. ACS Macro Letters. 7 (6), 762-766 (2018).
  68. Hugel, T., et al. Elasticity of Single Polyelectrolyte Chains and Their Desorption from Solid Supports Studied by AFM Based Single Molecule Force Spectroscopy. Macromolecules. 34 (4), 1039-1047 (2001).

Tags

Single Molecule Force SpectroscopyAFM-based Force SpectroscopyCovalent AttachmentPolymer BindingSilane-PEG-malPlasma ActivationToluenePEGPolystyrenePolynipamCapillary ForcesControl Samples

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kolberg, A., Wenzel, C., Hugel, T., Gallei, M., Balzer, B. N. Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (157), e60934, doi:10.3791/60934 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image