Summary

Лазерная травма головного мозга в моторном кортексе крыс

Published: September 26, 2020
doi:

Summary

Протокол, представленный здесь показывает технику создания модели грызунов черепно-мозговой травмы. Описанный здесь метод использует лазерное облучение и нацелен на моторную кору.

Abstract

Общий метод индуцирования инсульта в экспериментальных моделях грызунов включает в себя переходный (часто обозначаемый как MCAO-t) или постоянный (обозначенный как MCAO-p) окклюзия средней мозговой артерии (MCA) с помощью катетера. Однако этот общепринятый метод имеет некоторые ограничения, что ограничивает его широкое применение. Индукция инсульта с помощью этого метода часто характеризуется высокой изменчивостью локализации и размера ишемической области, периодическими случаями кровоизлияния и высокими показателями смертности. Кроме того, успешное завершение любой из переходных или постоянных процедур требует опыта и часто длится около 30 минут. В этом протоколе представлена техника лазерного облучения, которая может служить альтернативным методом для индуцирования и изучения черепно-мозговой травмы в моделях грызунов.

По сравнению с крысами в контрольных и MCAO групп, черепно-мозговая травма лазерной индукции показали снижение изменчивости температуры тела, объема инфаркта, отек мозга, внутричерепное кровоизлияние, и смертность. Кроме того, использование лазерной индуцированной травмы вызвало повреждение тканей головного мозга только в моторной коре, в отличие от экспериментов MCAO, где наблюдается разрушение как моторной коры, так и стриатальных тканей.

Результаты этого исследования показывают, что лазерное облучение может служить в качестве альтернативного и эффективного метода для индуцирования черепно-мозговой травмы в моторной коре. Метод также сокращает время завершения процедуры и не требует опытных обработчиков.

Introduction

Во всем мире инсульт является второй по величине причиной смерти и третьей по счету причинойинвалидности 1. Инсульт также приводит к тяжелой инвалидности, часто требующей дополнительной помощи со стороны медицинского персонала и родственников. Существует, следовательно, необходимо понять осложнений, связанных с расстройством и улучшить потенциал для более положительных результатов.

Использование моделей животных является первым шагом к пониманию заболеваний. Для обеспечения наилучших результатов исследований типичная модель будет включать простую технику, доступность, высокую воспроизводимость и минимальную изменчивость. Детерминанты в моделях ишемического инсульта включают объем отеков мозга, размер инфаркта, степень распада гемового барьера (BBB) и функциональные нарушения, обычно оцениваемые с помощью неврологического баллатяжести 2.

Наиболее широко используемая методика индукции инсульта в моделях грызунов затмевает среднюю мозговую артерию (MCA) преходяще или постоянно3. Этот метод производит модель инсульта похож на те, в организме человека: он имеет полутени, окружающие погладил области, является весьма воспроизводимой, и регулирует продолжительность ишемии и reperfusion4. Тем не менее, метод MCAO имеет некоторые осложнения. Техника склонна к внутричерепным кровоизлияниям и повреждению ипсилатеральной сетчатки с дисфункцией зрительной коры и общей гипертермией, что часто приводит кдополнительным исходам 5,,6,,7. Другие ограничения включают высокие различия в индуцированном инсульте (в результате вероятного распространения ишемии на непреднамеренные регионы, такие как область внешней сонной артерии), недостаточное окклюзии MCA, и преждевременное реперфузии. Кроме того, крысы различных штаммов и размеров обладают различными инфарктными томами8. В дополнение ко всем упомянутым недостаткам, модель MCAO не может вызвать небольшие изолированные инсульты в глубоких областях мозга, поскольку она технически ограничена с точки зрения требования минимального размера сосуда для катетеризации. Это делает потребность в альтернативной модели еще более критической. Другой метод, фототромбоз, обеспечивает возможную альтернативу процедурам MCAO, но не повышает эффективность9. Этот метод цели инсульта со светом и предлагает некоторые улучшения на предыдущих моделях. Тем не менее, фототромбоз требует инвазивной краниотомии, которая связана со вторичными compications9.

В свете изложенных недостатков представленный здесь протокол предоставляет способную альтернативную лазерную технику для индуцирования черепно-мозговой травмы у грызунов. Механизм действия лазерной техники основан на фототермальных эффектах лазера на живые ткани, что приводит к поглощению световых лучей тканями организма и их превращению в тепло. Преимущества использования лазерной техники являются его безопасность и простота манипуляции. Способность лазера производить тепло, чтобы остановить кровотечение делает его очень важным в медицине, в то время как его способность усиливать различные лучи в данной точке встречи гарантирует, что лазеры избежать уничтожения здоровых тканей, что стоит на пути точкимишени 10. Лазерный луч, используемый в этом протоколе, может проходить через низкую жидкую среду, такую как кость, не излучая ее энергию и/или не вызывая никаких разрушений. Как только он достигает высокой жидкой среды, такой как ткани мозга, он использует свою энергию, чтобы уничтожить ткани-мишени. Техника, таким образом, может вызвать черепно-мозговую травму только в соответствующей области мозга.

Техника, представленная здесь, показала огромную способность регулировать свои уровни облучения, производя выбранные вариации черепно-мозговой травмы, предназначенные с самого начала. В отличие от оригинального MCAO, который влияет как коры и стриатума, лазерная техника была в состоянии регулировать воздействие черепно-мозговой травмы, вызывая травмы только на предполагаемой моторной коры. В этом случае предусмотрен протокол о лазерной черепно-мозговой травме и резюме репрезентативных результатов процедуры, выполняемой на коре головного мозга крыс.

Protocol

Следующая процедура была проведена в соответствии с Руководящими принципами использования экспериментальных животных Европейского сообщества. Эксперименты были также одобрены Комитетом по уходу за животными в Университете Бен-Гуриона в Негеве. 1. Отбор и подготовка жи?…

Representative Results

Ни в контрольных, ни в экспериментальных группах (таблица1)не было зарегистрировано ни одного случая смерти или SAH. Уровень смертности в группе MCAO составил 20%. Относительные изменения температуры тела у крыс обеих групп также были похожи, несмотря на разницу в изм…

Discussion

Справедливо предположить, что лазерная техника является минимально инвазивной, учитывая, что никаких смертей или SAH не произошло в лазерной группе. Основной причиной смерти и SAH является повреждение кровеносных сосудов, что приводит к повышению внутричерепного давления (ICP), как показа?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Благодарим кафедру анестезиологии Медицинского центра Университета Сороки и сотрудников лаборатории Университета Бен-Гуриона в Негеве за помощь в проведении этого эксперимента.

Materials

2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride SIGMA – ALDRICH 298-96-4
50% trichloroacetic acid SIGMA – ALDRICH 76-03-9
Brain & Tissue Matrices SIGMA – ALDRICH 15013
Cannula Venflon 22 G KD-FIX 1.83604E+11
Centrifuge Sigma 2-16P SIGMA – ALDRICH Sigma 2-16P
Compact Analytical Balances SIGMA – ALDRICH HR-AZ/HR-A
Digital Weighing Scale SIGMA – ALDRICH Rs 4,000
Dissecting scissors SIGMA – ALDRICH Z265969
Eppendorf pipette SIGMA – ALDRICH Z683884
Eppendorf Tube SIGMA – ALDRICH EP0030119460
Ethanol 96 % ROMICAL Flammable Liquid
Evans Blue 2% SIGMA – ALDRICH 314-13-6
Fluorescence detector Tecan, Männedorf Switzerland model Infinite 200 PRO multimode reader
Heater with thermometer Heatingpad-1 Model: HEATINGPAD-1/2
Infusion Cuff ABN IC-500
Isofluran, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc NDC 66794-017
Multiset TEVA MEDICAL 998702
Olympus BX 40 microscope Olympus
Optical scanner Canon Cano Scan 4200F
Petri dishes SIGMA – ALDRICH P5606
Scalpel blades 11 SIGMA – ALDRICH S2771
Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine Laser Industries Ltd
Stereotaxic head holder KOPF 900LS
Sterile Syringe 2 ml Braun 4606027V
Syringe-needle 27 G Braun 305620

References

  1. World Health Organization. Global health estimates: deaths by cause, age, sex and country, 2000-2012. World Health Organization. 9, (2014).
  2. Meadows, K. L. Experimental models of focal and multifocal cerebral ischemia: a review. Reviews in the Neurosciences. 29, 661-674 (2018).
  3. Durukan, A., Strbian, D., Tatlisumak, T. Rodent models of ischemic stroke: a useful tool for stroke drug development. Current Pharmaceutical Designs. 14, 359-370 (2008).
  4. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
  5. Li, F., Omae, T., Fisher, M. Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats. Stroke. 30, 2464-2470 (1999).
  6. Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
  7. Zhao, Q., Memezawa, H., Smith, M. L., Siesjo, B. K. Hyperthermia complicates middle cerebral artery occlusion induced by an intraluminal filament. Brain Research. 649, 253-259 (1994).
  8. Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Experimental and Translational Stroke Medicine. 1, 8 (2009).
  9. Choi, B. I., et al. Neurobehavioural deficits correlate with the cerebral infarction volume of stroke animals: a comparative study on ischaemia-reperfusion and photothrombosis models. Environmental Toxicology and Pharmacology. 33, 60-69 (2012).
  10. Boyko, M., et al. An Alternative Model of Laser-Induced Stroke in the Motor Cortex of Rats. Biological Procedure Online. 21, 9 (2019).
  11. Bleilevens, C., et al. Effect of anesthesia and cerebral blood flow on neuronal injury in a rat middle cerebral artery occlusion (MCAO) model. Experimental Brain Research. 224, 155-164 (2013).
  12. Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. (147), e58875 (2019).
  13. Boyko, M., et al. Morphological and neuro-behavioral parallels in the rat model of stroke. Behavioural Brain Research. 223, 17-23 (2011).

Play Video

Cite This Article
Kuts, R., Melamed, I., Shiyntum, H. N., Gruenbaum, B. F., Frank, D., Knyazer, B., Natanel, D., Severynovska, O., Vinokur, M., Boyko, M. Laser-Induced Brain Injury in the Motor Cortex of Rats. J. Vis. Exp. (163), e60928, doi:10.3791/60928 (2020).

View Video