Laser-Geïnduceerde hersenletsel in de motorische cortex van ratten
Summary
Het hier gepresenteerde protocol toont een techniek om een knaagdiermodel van hersenletsel te creëren. De hier beschreven methode maakt gebruik van laserbestraling en richt zich op de motorische cortex.
Abstract
Een veel voorkomende techniek voor het induceren van een beroerte in experimentele knaagdier modellen omvat de voorbijgaande (vaak aangeduid als MCAO-t) of permanente (aangeduid als MCAO-p) occlusie van de middelste hersenslagader (MCA) met behulp van een katheter. Deze algemeen aanvaarde techniek heeft echter een aantal beperkingen, waardoor het uitgebreide gebruik ervan wordt beperkt. Slaginductie door deze methode wordt vaak gekenmerkt door hoge variabiliteit in de lokalisatie en grootte van het ischemische gebied, periodieke gebeurtenissen van bloeding, en hoge sterftecijfers. Ook de succesvolle voltooiing van een van de voorbijgaande of permanente procedures vereist expertise en duurt vaak ongeveer 30 minuten. In dit protocol wordt een laserbestralingstechniek gepresenteerd die kan dienen als een alternatieve methode voor het opwekken en bestuderen van hersenletsel in knaagdiermodellen.
In vergelijking met ratten in de controle- en MCAO-groepen vertoonde het hersenletsel door laserinductie verminderde variabiliteit in lichaamstemperatuur, infarctvolume, hersenoedeem, intracraniale bloeding en sterfte. Bovendien veroorzaakte het gebruik van een laser-geïnduceerde verwonding schade aan de hersenweefsels alleen in de motorische cortex in tegenstelling tot in de MCAO-experimenten waar vernietiging van zowel de motorische cortex als striatale weefsels wordt waargenomen.
Bevindingen uit dit onderzoek suggereren dat laser bestraling kan dienen als een alternatieve en effectieve techniek voor het induceren van hersenletsel in de motorische cortex. De methode verkort ook de tijd voor het voltooien van de procedure en vereist geen deskundige handlers.
Introduction
Wereldwijd, beroerte is de tweede belangrijkste doodsoorzaak en de derde belangrijkste oorzaak van invaliditeit1. Beroerte leidt ook tot ernstige invaliditeit, vaak die extra zorg van medisch personeel en familieleden. Er is daarom een noodzaak om de complicaties in verband met de aandoening te begrijpen en het verbeteren van het potentieel voor meer positieve resultaten.
Het gebruik van diermodellen is de eerste stap naar het begrijpen van ziekten. Om de beste onderzoeksresultaten te garanderen, zou een typisch model een eenvoudige techniek, betaalbaarheid, hoge reproduceerbaarheid en minimale variabiliteit bevatten. De determinanten in ischemische beroerte modellen omvatten hersenoedeem volume, infarct grootte, de omvang van de bloed-hersenbarrière (BBB) afbraak, en functionele stoornis over het algemeen geëvalueerd via neurologische ernst score2.
De meest gebruikte slag inductie techniek in knaagdier modellen occludes de middelste cerebrale slagader (MCA) tijdelijk of permanent3. Deze techniek produceert een lijn model vergelijkbaar met die bij de mens: het heeft een penumbra rond het gestoste gebied, is zeer reproduceerbaar, en reguleert ischemie duur en reperfusie4. Toch heeft de MCAO-methode enkele complicaties. De techniek is gevoelig voor intracraniale bloeding en letsel aan het ipsilaterale netvlies met een disfunctie van de visuele cortex en gemeenschappelijke hyperthermie die vaak leiden tot extra uitkomsten5,6,7. Andere beperkingen zijn hoge variaties in geïnduceerde beroerte (als gevolg van de waarschijnlijke uitbreiding van de ischemie tot onbedoelde gebieden, zoals de externe halsslagader regio), onvoldoende occlusie van de MCA, en vroegtijdige reperfusie. Ook ratten van verschillende stammen en maten vertonen verschillende infarct volumes8. Naast alle genoemde nadelen kan het MCAO-model geen kleine geïsoleerde beroertes veroorzaken in diepe hersengebieden, omdat het technisch beperkt is in termen van de vereiste van minimale vatgrootte voor katheterisatie. Dit maakt de behoefte aan een alternatief model des te kritischer. Een andere methode, fototrombose, biedt een mogelijk alternatief voor MCAO-procedures, maar verbetert de efficiëntie niet9. Deze techniek richt zich op slag met licht en biedt een aantal verbeteringen ten opzichte van de vorige modellen. Fototrombose vereist echter een invasieve craniotomie die wordt geassocieerd met secundaire compicaties9.
In het licht van geschetste tekortkomingen, het protocol hier gepresenteerd biedt een capabele alternatieve laser techniek voor het induceren van hersenletsel bij knaagdieren. Het werkingsmechanisme van de lasertechniek is gebaseerd op de fotothermale effecten van de laser die worden bijgebracht op levende weefsels, wat leidt tot de absorptie van lichtstralen door lichaamsweefsels en hun omzetting in warmte. De voordelen van het gebruik van een lasertechniek zijn de veiligheid en het gemak van manipulatie. Het vermogen van een laser om warmte te produceren om te stoppen met bloeden maakt het erg belangrijk in de geneeskunde, terwijl het vermogen om verschillende stralen op een bepaald meetpunt te versterken ervoor zorgt dat lasers voorkomen dat ze gezonde weefsels vernietigen die het doelpunt10in de weg staan. De laserstraal die in dit protocol wordt gebruikt, kan door een laag vloeibaar medium, zoals bot, gaan zonder zijn energie uit te stoten en/of vernietiging te veroorzaken. Zodra het een hoog vloeibaar medium bereikt, zoals hersenweefsels, gebruikt het zijn energie om de doelweefsels te vernietigen. De techniek kan daarom alleen hersenletsel veroorzaken in het juiste gebied van de hersenen.
De hier gepresenteerde techniek toonde een enorme hoeveelheid vermogen om de niveaus van bestraling te reguleren, waardoor de gekozen variaties van hersenletsel bedoeld vanaf het begin. In tegenstelling tot de oorspronkelijke MCAO die zowel de cortex als het striatum beïnvloedt, was de lasertechniek in staat om de impact van hersenletsel te reguleren, waardoor letsel alleen op de beoogde motorische cortex werd veroorzaakt. Hierin, de laser-geïnduceerde hersenletsel protocol en een samenvatting van de representatieve resultaten voor de procedure uitgevoerd op de hersenschors van ratten zijn voorzien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is eerlijk om aan te nemen dat de lasertechniek minimaal invasief is, gezien het feit dat er geen sterfgevallen of SAH in de lasergroep zijn opgetreden. De belangrijkste doodsoorzaak en SAH is de schade aan bloedvaten die leidt tot een verhoging van de intracraniale druk (ICP), zoals blijkt uit de oorspronkelijke MCAO-technieken10. De afwezigheid van overlijden en SAH in de lasergroep is waarschijnlijk te wijten aan de specifieke effecten van lasers: ze hebben geen directe invloed op de bloedv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen de afdeling Anesthesiologie van het Soroka Universitair Medisch Centrum en de laboratoriummedewerkers van de Ben-Gurion Universiteit van de Negev bedanken voor hun hulp bij de uitvoering van dit experiment.
Materials
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | SIGMA – ALDRICH | 298-96-4 | |
| 50% trichloroacetic acid | SIGMA – ALDRICH | 76-03-9 | |
| Brain & Tissue Matrices | SIGMA – ALDRICH | 15013 | |
| Cannula Venflon 22 G | KD-FIX | 1.83604E+11 | |
| Centrifuge Sigma 2-16P | SIGMA – ALDRICH | Sigma 2-16P | |
| Compact Analytical Balances | SIGMA – ALDRICH | HR-AZ/HR-A | |
| Digital Weighing Scale | SIGMA – ALDRICH | Rs 4,000 | |
| Dissecting scissors | SIGMA – ALDRICH | Z265969 | |
| Eppendorf pipette | SIGMA – ALDRICH | Z683884 | |
| Eppendorf Tube | SIGMA – ALDRICH | EP0030119460 | |
| Ethanol 96 % | ROMICAL | Flammable Liquid | |
| Evans Blue 2% | SIGMA – ALDRICH | 314-13-6 | |
| Fluorescence detector | Tecan, Männedorf Switzerland | model Infinite 200 PRO multimode reader | |
| Heater with thermometer | Heatingpad-1 | Model: HEATINGPAD-1/2 | |
| Infusion Cuff | ABN | IC-500 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | NDC 66794-017 | |
| Multiset | TEVA MEDICAL | 998702 | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| Optical scanner | Canon | Cano Scan 4200F | |
| Petri dishes | SIGMA – ALDRICH | P5606 | |
| Scalpel blades 11 | SIGMA – ALDRICH | S2771 | |
| Sharplan 3000 Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminum garnet) laser machine | Laser Industries Ltd | ||
| Stereotaxic head holder | KOPF | 900LS | |
| Sterile Syringe 2 ml | Braun | 4606027V | |
| Syringe-needle 27 G | Braun | 305620 |
References
- World Health Organization. Global health estimates: deaths by cause, age, sex and country, 2000-2012. World Health Organization. 9, (2014).
- Meadows, K. L. Experimental models of focal and multifocal cerebral ischemia: a review. Reviews in the Neurosciences. 29, 661-674 (2018).
- Durukan, A., Strbian, D., Tatlisumak, T. Rodent models of ischemic stroke: a useful tool for stroke drug development. Current Pharmaceutical Designs. 14, 359-370 (2008).
- Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Design, Development and Therapy. 9, 3445-3454 (2015).
- Li, F., Omae, T., Fisher, M. Spontaneous hyperthermia and its mechanism in the intraluminal suture middle cerebral artery occlusion model of rats. Stroke. 30, 2464-2470 (1999).
- Boyko, M., et al. An experimental model of focal ischemia using an internal carotid artery approach. Journal of Neuroscience Methods. 193, 246-253 (2010).
- Zhao, Q., Memezawa, H., Smith, M. L., Siesjo, B. K. Hyperthermia complicates middle cerebral artery occlusion induced by an intraluminal filament. Brain Research. 649, 253-259 (1994).
- Braeuninger, S., Kleinschnitz, C. Rodent models of focal cerebral ischemia: procedural pitfalls and translational problems. Experimental and Translational Stroke Medicine. 1, 8 (2009).
- Choi, B. I., et al. Neurobehavioural deficits correlate with the cerebral infarction volume of stroke animals: a comparative study on ischaemia-reperfusion and photothrombosis models. Environmental Toxicology and Pharmacology. 33, 60-69 (2012).
- Boyko, M., et al. An Alternative Model of Laser-Induced Stroke in the Motor Cortex of Rats. Biological Procedure Online. 21, 9 (2019).
- Bleilevens, C., et al. Effect of anesthesia and cerebral blood flow on neuronal injury in a rat middle cerebral artery occlusion (MCAO) model. Experimental Brain Research. 224, 155-164 (2013).
- Kuts, R., et al. A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats. Journal of Visualized Experiments. (147), e58875 (2019).
- Boyko, M., et al. Morphological and neuro-behavioral parallels in the rat model of stroke. Behavioural Brain Research. 223, 17-23 (2011).
