Análisis de defectos cardíacos congénitos en embriones de ratón utilizando métodos histológicos cualitativos y cuantitativos
Summary
En este protocolo, describimos procedimientos para analizar cualitativa y cuantitativamente fenotipos del desarrollo en ratones asociados con defectos cardíacos congénitos.
Abstract
Los defectos cardíacos congénitos (CHD) son el tipo más común de defecto congénito en los seres humanos, afectando hasta el 1% de todos los nacimientos vivos. Sin embargo, las causas subyacentes de la ENFERMEDAD de Haya todavía se entienden mal. El ratón en desarrollo constituye un modelo valioso para el estudio de la CHD, ya que los programas de desarrollo cardíaco entre ratones y humanos están altamente conservados. El protocolo describe en detalle cómo producir embriones de ratón de la etapa gestacional deseada, métodos para aislar y preservar el corazón para el procesamiento posterior, métodos cuantitativos para identificar tipos comunes de CHD por histología (por ejemplo, septal ventricular defectos, defectos interauriculares, conducto arterial patentado) y métodos cuantitativos de histomorfometría para medir fenotipos comunes de compactación muscular. Estos métodos articulan todos los pasos involucrados en la preparación, recolección y análisis de muestras, permitiendo a los científicos medir correctamente y reproduciblemente la CHD.
Introduction
Las CHD son el tipo más común de defecto de nacimiento en humanos y son la principal causa de muertes relacionadas con defectos de nacimiento1,2,3,4,5,6. Aunque alrededor del 90% de los niños recién nacidos sobreviven a la enfermedad coronaria, con frecuencia se asocia con una morbilidad significativa e intervenciones médicas a lo largo de los años, imponiendo una pesada carga sobre la vida de los pacientes y el sistema de salud7,8,9,10. Fuera de los factores puramente genéticos, las causas de la ENFERMEDAD se entienden mal4. Las causas no identificadas representan el 56-66% de todos los casos de CHD según la Asociación Americana del Corazón y otras fuentes2,3,4,11. Los factores bien conocidos incluyen mutaciones genéticas, CNVs, variantes de nucleótidos individuales de novo y aneuploidía. Se sospecha que los factores ambientales y dietéticos son también fuentes importantes que contribuyen a la enfermedad de Son obligatorias, como sugieren los estudios epidemiológicos que vinculan el estilo de vida materno2,12,la privación económica y la carrera13,y mediante la investigación en factores dietéticos como el ácido fólico11,14 y el ácido retinoico lipídico bioactivo15,16. Investigar los mecanismos y causas de la ENFERMEDAD y otros defectos cardiovasculares es importante desarrollar estrategias preventivas y nuevas opciones terapéuticas1,4,17,18,19.
El ratón en desarrollo es un modelo de piedra angular para el estudio de la CHD en mamíferos. Sin embargo, algunos de los métodos y análisis empleados, como las disecciones que preservan la morfología del corazón, el análisis de las etapas del desarrollo y la identificación de defectos asociados a la CHD, pueden ser desalentadores para los científicos que son nuevos en el análisis de los corazones murinos. El objetivo de los métodos descritos en este protocolo es ofrecer directrices cualitativas y cuantitativas para estos procesos. Así, en este protocolo explicamos cómo realizar aparejos cronometrados para producir embriones de la etapa gestacional deseada, diseccionar a las hembras embarazadas para la recuperación intacta del corazón (incluyendo los tejidos asociados como el tracto de salida), la fijación del corazón y la preparación para seccionamiento de criostatos, métodos de histología básica, análisis cuantitativos de defectos cardíacos comunes y análisis cualitativos de la compactación del músculo cardíaco, un fenotipo precursor común para algunos tipos de CHD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo explora las técnicas involucradas en el análisis del desarrollo cardíaco en corazones embrionarios. Algunas limitaciones de este método son la destreza física requerida para las técnicas preparatorias, que pueden requerir práctica, y habilidad con imágenes de microscopio. Si las rodajas obtenidas en el criostato son desordenadas, la tinción de hematoxilina y eosina no será clara, o si las imágenes tomadas en el microscopio tienen mala iluminación, entonces el método utilizado con ImageJ no fun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El Laboratorio Aguirre es apoyado por el Instituto Nacional del Corazón, Pulmón y Sangre de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio K01HL135464 y por la Asociación Americana del Corazón bajo el número de premio 19IPLOI34660342.
Materials
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J – stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat – Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) – p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
- Kathiresan, S., Srivastava, D. Genetics of human cardiovascular disease. Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).
- Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: The glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Pelech, A. N., Broeckel, U. Toward the etiologies of congenital heart diseases. Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).
- Zaidi, S., Brueckner, M. Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease. Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).
- Kenny, L. A., et al. Transplantation in the single ventricle population. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).
- Navaratnam, D., et al. Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation. The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).
- De Leval, M. R., Deanfield, J. E. Four decades of Fontan palliation. Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).
- Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).
- Jenkins, K. J., et al. Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge – A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young. Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).
- Botto, L. D., et al. Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study. Archives of Disease in Childhood – Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).
- Knowles, R. L., et al. Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects. Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).
- Feng, Y., et al. Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies. Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Liu, Y., et al. Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).
- Kurian, L., et al. Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development. Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).
- Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond. Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).
- Srivastava, D. Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis. Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- . Stage Definition Available from: https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998)
- Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017)
- . Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007)
- MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness. IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).
- Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy. Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).
- Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).
