Анализ врожденных пороков сердца в эмбрионах маусов с использованием квалификационных и количественных гистологических методов
Summary
В этом протоколе мы описываем процедуры качественного и количественного анализа фенотипов развития у мышей, связанных с врожденными пороками сердца.
Abstract
Врожденные пороки сердца (ИБС) являются наиболее распространенным типом врожденных дефектов у людей, затрагивающих до 1% всех живорождений. Тем не менее, основные причины ИКД по-прежнему плохо изучены. Развивающаяся мышь представляет собой ценную модель для изучения ИКД, потому что сердечные программы развития между мышами и людьми очень сохраняются. Протокол подробно описывает, как производить эмбрионы мыши желаемой гестационной стадии, методы изоляции и сохранения сердца для обработки ниже по течению, количественные методы выявления распространенных типов ИБС по гистологии (например, желудочковая перепдал дефекты, дефекты межпредсердной перегородки, патентный артериоз протока и количественные методы гистоморфометрии для измерения общих фенотипов мышечного уплотнения. Эти методы сформулировать все шаги, связанные с подготовкой образца, сбор омывании и анализа, что позволяет ученым правильно и воспроизводимо измерять ИБС.
Introduction
ИБС являются наиболее распространенным типом врожденных дефектов у людей и являются основной причиной смерти, связанной с врожденными дефектами1,2,3,4,5,6. Хотя около 90% новорожденных детей выживают ИБС, это часто связано со значительной заболеваемости и медицинских вмешательств на протяжении многих лет, налагая тяжелое бремя на жизнь пациентов и системы здравоохранения7,8,9,10. Вне чисто генетических факторов, причины ИКД плохо изучены4. Неизвестные причины составляют 56-66% всех случаев ИКД в соответствии с Американской ассоциацией сердца и других источников2,3,4,11. Известные факторы включают генетические мутации, CNV, de novo одиночным нуклеотидным вариантом и анеуплоидией. Он подозревается, что экологические и диетические факторы также являются важными источниками, способствующими ИБС, как это предлагается эпидемиологических исследований, связывающих материнский образ жизни2,12, экономические лишения, и расы13, а также исследования диетических факторов, таких как фолиевая кислота11,14 и биоактивных липидной ретиноиновой кислоты15,16. Изучение механизмов и причин ИБС и других сердечно-сосудистых дефектов важно разработать профилактические стратегии и новые терапевтические варианты1,4,17,18,19.
Развивающаяся мышь является краеугольной моделью для изучения ИКВ у млекопитающих. Тем не менее, некоторые из используемых методов и анализов, таких как вскрытие, сохраняющее морфологию сердца, анализ стадий развития и выявление связанных с ИБС дефектов, могут быть пугающими для ученых, которые являются новыми для анализа сердца мурина. Цель методов, описанных в данном протоколе, заключается в предоставлении качественных и количественных руководящих принципов для этих процессов. Таким образом, в этом протоколе мы объясняем, как выполнять приуроченные спаривания для получения эмбрионов желаемой гестационной стадии, вскрыть беременных женщин для нетронутого восстановления сердца (в том числе связанных тканей, таких как отток тракта), фиксации сердца и подготовки к криостат секции, основные методы гистологии, количественный анализ общих пороков сердца, и качественный анализ уплотнения мышц сердца, общий фенотип прекурсора для некоторых типов ИБС.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол исследует методы, связанные с анализом сердечного развития в эмбриональных сердцах. Некоторые ограничения этого метода являются необходимой физической ловкости для подготовительных методов, которые могут потребовать практики, и мастерство с микроскопом изображения. Е?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Лаборатория Агирре поддерживается Национальным институтом сердца, легких и крови Национальных институтов здравоохранения под номером премии K01HL135464 и Американской ассоциацией сердца под номером 19IPLOI34660342.
Materials
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J – stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat – Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) – p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
- Kathiresan, S., Srivastava, D. Genetics of human cardiovascular disease. Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).
- Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: The glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Pelech, A. N., Broeckel, U. Toward the etiologies of congenital heart diseases. Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).
- Zaidi, S., Brueckner, M. Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease. Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).
- Kenny, L. A., et al. Transplantation in the single ventricle population. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).
- Navaratnam, D., et al. Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation. The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).
- De Leval, M. R., Deanfield, J. E. Four decades of Fontan palliation. Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).
- Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).
- Jenkins, K. J., et al. Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge – A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young. Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).
- Botto, L. D., et al. Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study. Archives of Disease in Childhood – Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).
- Knowles, R. L., et al. Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects. Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).
- Feng, Y., et al. Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies. Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Liu, Y., et al. Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).
- Kurian, L., et al. Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development. Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).
- Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond. Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).
- Srivastava, D. Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis. Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- . Stage Definition Available from: https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998)
- Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017)
- . Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007)
- MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness. IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).
- Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy. Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).
- Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).
