Análise de defeitos cardíacos congênitos em embriões de camundongos usando métodos histológicos qualitativos e quantitativos
Summary
Neste protocolo, descrevemos procedimentos para analisar qualitativamente e quantitativamente fenótipos de desenvolvimento em camundongos associados a defeitos cardíacos congênitos.
Abstract
Os defeitos cardíacos congênitos (DCh) são o tipo mais comum de defeito de nascimento em humanos, afetando até 1% de todos os nascidos vivos. No entanto, as causas subjacentes à DCh ainda são pouco compreendidas. O camundongo em desenvolvimento constitui um modelo valioso para o estudo da ChD, porque os programas de desenvolvimento cardíaco entre camundongos e humanos são altamente conservados. O protocolo descreve em detalhes como produzir embriões de camundongos do estágio gestacional desejado, métodos para isolar e preservar o coração para processamento a jusante, métodos quantitativos para identificar tipos comuns de CHD por histologia (por exemplo, septal ventricular defeitos, defeitos septos atrial, patente ductus arteriosus) e métodos quantitativos de histomormormetria para medir fenótipos comuns de compactação muscular. Esses métodos articulam todas as etapas envolvidas na preparação, coleta e análise da amostra, permitindo aos cientistas medir corretamente e reprodutivelmente a CHD.
Introduction
Os CHDs são o tipo mais comum de defeito de nascimento em humanos e são a principal causa de mortes relacionadas a defeitos congênitos1,2,3,4,5,6. Embora cerca de 90% das crianças recém-nascidas sobrevivam à Dra, ela é frequentemente associada a significativa morbidade e intervenções médicas ao longo dos anos, impondo um fardo pesado na vida dos pacientes e no sistema de saúde7,8,9,10. Fora fatores puramente genéticos, as causas da DCh são mal compreendidas4. As causas não identificadas representam ~56-66% de todos os casos de CHD de acordo com a American Heart Association e outras fontes2,3,4,11. Fatores bem conhecidos incluem mutações genéticas, CNVs, variantes de novo nucleotídeo único e aneuploidia. Suspeita-se que fatores ambientais e dietéticos também sejam fontes importantes que contribuem para a DCH, como sugerem estudos epidemiológicos que ligam o estilo de vida materno2,12, privação econômica e raça13, e por pesquisas sobre fatores dietéticos como o ácido fólico11,14 e o ácido retinóico lipídico bioativo15,16. Investigar os mecanismos e causas da Doença e outros defeitos cardiovasculares é importante para desenvolver estratégias preventivas e novas opções terapêuticas1,4,17,18,19.
O camundongo em desenvolvimento é um modelo fundamental para estudar CHD em mamíferos. No entanto, alguns dos métodos e análises empregados, como dissecções que preservam a morfologia cardíaca, análise de estágios de desenvolvimento e identificação de defeitos associados à ChD, podem ser assustadores para os cientistas que são novos na análise de corações murina. O objetivo dos métodos descritos neste protocolo é oferecer diretrizes qualitativas e quantitativas para esses processos. Assim, neste protocolo explicamos como realizar acasalamentos cronometrados para produzir embriões do estágio gestacional desejado, dissecar fêmeas grávidas para recuperação cardíaca intacta (incluindo tecidos associados, como o trato de saída), fixação cardíaca e preparação para secção criostato, métodos básicos de histologia, análises quantitativas de defeitos cardíacos comuns e análise qualitativa da compactação muscular cardíaca, um fenótipo precursor comum para alguns tipos de CHD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo explora as técnicas envolvidas na análise do desenvolvimento cardíaco em corações embrionários. Algumas limitações deste método são a destreza física necessária para as técnicas preparatórias, que podem exigir prática, e habilidade com imagens de microscópio. Se as fatias obtidas no criostato forem bagunçadas, a coloração de hematoxilina e eosina não será clara, ou se as imagens tiradas no microscópio tiverem pouca iluminação, então o método usado com imagej não funcionará. Uma …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O Aguirre Lab é apoiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute dos Institutos Nacionais de Saúde o número do prêmio K01HL135464 e pela American Heart Association o prêmio número 19IPLOI34660342.
Materials
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J – stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat – Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) – p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
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