Summary

定性・定量的組織学的手法を用いたマウス胚における先天性心不全の解析

Published: March 10, 2020
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Summary

本議定書では、先天性心不全に関連するマウスの発達表現型を定性的かつ定量的に分析する手順を説明する。

Abstract

先天性心不全(CHD)は、ヒトの出生時欠損の最も一般的なタイプであり、すべての出生の最大1%に影響を及ぼす。しかし、CHDの根本的な原因はまだ十分に理解されていません。開発中のマウスは、マウスとヒトの間の心臓発達プログラムが非常に保存されているため、CHDの研究にとって貴重なモデルです。プロトコルは、所望の妊娠段階のマウス胚を生成する方法、下流処理のために心臓を分離して保存する方法、構造学によってCHDの一般的なタイプを識別する定量的方法(例えば、心室中隔)を詳細に記述する欠陥、心房中隔欠損、特許性管管動脈管)、および定量的な構造学法は、一般的な筋圧膜型を測定する。これらの方法は、サンプルの調製、収集、および分析に関与するすべてのステップを明確にし、科学者がCHDを正しく、再現的に測定することを可能にします。

Introduction

CHDは、ヒトにおける出生時欠損の最も一般的なタイプであり、出生時欠損関連死の主な原因である1、2、3、4、5、6。新生児の約90%がCHDを生き残っているが、それはしばしば、患者の生活と医療システム7、8、9、10に大きな負担を課す、長年にわたって重大な罹患率および医学的介入に関連している。純粋に遺伝的要因の外では、CHDの原因は十分に理解されていません4.未確認の原因は、米国心臓協会およびその他の情報源2、3、4、11によると、すべてのCHD症例の約56-66%める。既知の因子には、遺伝子変異、CTV、デノボ単一ヌクレオチド変異、および異数体が含まれる。母体の生活様式2、12、経済的剥奪および人種13を結ぶ疫学的研究によって示唆されるように、環境および食事因子もCHDに寄与する重要な供給源であると疑われる。CHDおよび他の心血管欠損のメカニズムと原因を調査することは、予防戦略および新しい治療オプション1、4、17、18、19を開発するために重要である。

開発中のマウスは、哺乳類のCHDを研究するための基礎モデルです。しかし、心臓形態を保存する分節、発達段階の分析、CHD関連欠陥の同定など、採用された方法や分析の中には、マウスの心臓の分析に新しい科学者にとっては困難な場合があります。このプロトコルで説明されている方法の目的は、これらのプロセスに対して定性的かつ定量的なガイドラインを提供することです。したがって、このプロトコルでは、所望の妊娠期の胚を産生するために時間交配を行い、無傷の心臓回復(流出路などの関連組織を含む)、心臓固定および準備のために妊婦を解剖する方法を説明するクライオスタット断面化、基本的な構造学的方法、一般的な心臓欠損の定量的分析、および心筋圧密の定性的分析は、いくつかのタイプのCHDに対する一般的な前駆体表現型である。

Protocol

本論文で参照されている実験で使用されたすべての動物は、ミシガン州立大学の施設動物ケア・使用委員会(IACUC)の動物ケアガイドラインを使用して治療した。 1. 胚生成のためのC57BL6/Jマウスのタイミング交配 マウスが繁殖年齢(6-8週間)に達したら、ハーレム繁殖形式(すなわち、1匹の雄1匹につき2匹の雌)にまとめる。午後または夕方に繁殖のためにそれらを設定?…

Representative Results

筋肉圧指数は、コントロールと実験群の2つの異なる環境下で発達する心臓の間で比較された。これらのプロトコルは、筋肉組織の圧縮を定量的に分析するために使用され、統計的分析が可能であった。筋肉圧圧は、非実験的条件で発症した胚に対して実験心臓において有意に減少することが示された。 観察のタイミング?…

Discussion

このプロトコルは、胚性心臓における心臓発達の分析に関与する技術を探る。この方法のいくつかの制限は、準備技術に必要な物理的な器用さであり、練習を必要とし、顕微鏡イメージングを伴うスキルを有する。クライオスタットで得られたスライスが乱雑な場合、ヘマトキシリンとエオシン染色が明確でない場合、または顕微鏡で撮影した画像の照明が悪い場合、ImageJで使用される方法?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

アギーレ研究所は、国立衛生研究所の国立心臓、肺、血液研究所の賞番号K01HL135464の下で、賞番号19IPLOI34660342の下で米国心臓協会によってサポートされています。

Materials

15 mL Conical Tube(s) Fisher Scientific # 1495970C
C57BL/6J Mice Jackson Labs C57BL/6J – stock 000664
Coplin Staining Jars (x6) VWR Scientific # 25457-006
Coverslips 24X50MM #1.5 VWR Scientific # 48393-241
Cryostat – Leica CM3050S Leica N/A
Dissecting Dish(s) Fisher Scientific # 50930381
Dumont #5 – Fine Forceps (x2) Fine Science Tools # 11254-20
Eosin Y Solution Millipore Sigma # HT110116-500ML
Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) Fisher Scientific # BP2818-500
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Millipore Sigma # E9884-100G
Eukitt Millipore Sigma # 03989-100ML
Fine Scissors Fine Science Tools # 14060-10
Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC Leica N/A
Glycine Millipore Sigma # 410225-250G
Graefe Forceps Fine Science Tools # 11052-10
Graphpad Prism 8 Software Graphpad
ImageJ Software ImageJ
Kimwipes Fisher Scientific # 06666A
Mayer's hematoxylin solution Millipore Sigma # MHS16-500ML
Micropipette tip(s) – p200 Fisher Scientific # 02707448
Microsoft Excel Software Microsoft
OCT Compound VWR Scientific # 102094-106
Olympus CkX53 Microscope Olympus
Paint Brushes (at least 2)
Paraformaldehyde VWR Scientific # 0215014601 Make into 4% solution (dissolved in PBS)
Pasteur pipette(s) Fisher Scientific # 13-711-7M
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific # 15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher Scientific # 70011044 Dilute from 10x to 1x before using
Scale Mettler Toledo # MS1602TS
Scale Mettler Toledo # MS105
Scalpel Handle #3 VWR Scientific # 10161-918
Scalpel Blades VWR Scientific # 21909-612
Square Mold VWR Scientific # 100500-224 For OCT molds
Sucrose Millipore Sigma # S9378-500G
Superfrost Plus Slides Fisher Scientific # 1255015
Surgical Scissors Fine Science Tools # 14002-14
Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades VWR Scientific # 25608-964
Travel Scale Acculab VIC 5101
Xylene Millipore Sigma 214736-1L

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Cite This Article
Ball, K., Kinne, R., Aguirre, A. Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods. J. Vis. Exp. (157), e60926, doi:10.3791/60926 (2020).

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