ניתוח של פגמים לב מולדים בעוברי עכבר באמצעות שיטות היסטולוגית איכותית וכמותית
Summary
בפרוטוקול זה, אנו מתארים הליכים באיכות ובכמת לנתח פנוטיפים התפתחותיים בעכברים הקשורים למומים מולדים לב.
Abstract
מומים לב מולדים (CHD) הם הסוג הנפוץ ביותר של פגם מולד בבני אדם, המשפיעים על 1% של כל לידות חי. עם זאת, הסיבות הבסיסיות ל-CHD עדיין מובנות בצורה עלובה. העכבר המתפתח מהווה מודל חשוב למחקר של CHD, מכיוון תוכניות התפתחותיות לב בין עכברים ובני אדם הם שמרו במידה רבה. הפרוטוקול מתאר בפרוטרוט כיצד לייצר עוברי העכבר של שלב ההיריון הרצוי, שיטות לבידוד ולשמר את הלב עבור עיבוד במורד הזרם, שיטות כמותיים כדי לזהות סוגים נפוצים של CHD על ידי היסטולוגיה (g., במחיצה הבין-חדרית פגמים, פרפור מומים בעלי גביע, כמותי מסוג דוטוס, ושיטות כמותית למדידת הפנוטיפים השכיחים של השרירים. שיטות אלה לבטא את כל השלבים המעורבים הכנה לדוגמה, איסוף, וניתוח, המאפשר למדענים למדוד בצורה נכונה מחקר CHD.
Introduction
Chds הם הסוג הנפוץ ביותר של פגם הלידה בבני אדם הם הגורם המוביל של לידה מוות פגמים הקשורים1,2,3,4,5,6. למרות כ 90% של הילדים היילוד לשרוד CHD, הוא משויך לעתים קרובות עם תחלואה משמעותית התערבויות רפואיות במהלך השנים, הטלת נטל כבד על חיי החולים ומערכת הבריאות7,8,9,10. מחוץ לגורמים גנטיים גרידא, הגורמים ל-CHD מובנים בצורה עלובה4. לא מזוהה גורם לחשבון של ~ 56-66% של כל המקרים CHD על פי איגוד הלב האמריקני ומקורות אחרים2,3,4,11. גורמים ידועים כוללים מוטציות גנטיות, CNVs, דה נובו נוקלאוטיד יחיד משתנים, ו aneuploidy. הוא חשד כי גורמים סביבתיים ותזונתיים הם גם מקורות חשובים לתרום CHD, כפי שהוצע על ידי מחקרים אפידמיולוגיים קישור אורח חיים אימהי2,12, מחסור כלכלי, ומרוץ13, ועל ידי מחקר לתוך גורמים תזונתיים כגון חומצה פולית11,14 ואת חומצה retinoic השומנים הביואקטיבית15,16. חקירת מנגנונים וגורמים של מומים וכלי דם אחרים חשוב לפתח אסטרטגיות מניעה ואפשרויות הטיפול הרומן1,4,17,18,19.
העכבר המתפתח הוא דגם אבן פינה ללימוד CHD ביונקים. עם זאת, חלק מהשיטות והניתוחים המועסקים, כגון ניתוח שמירה על מורפולוגיה של הלב, אנליזה של שלבים התפתחותיים וזיהוי של פגמים משויכים ב-CHD, יכולים להרתיע מדענים החדשים לניתוח לבבות מורתיים. מטרת השיטות המתוארות בפרוטוקול זה היא להציע קווים מנחים איכותיים וכמותיים לתהליכים אלה. כך, בפרוטוקול זה אנו מסבירים כיצד לבצע מצות מתוזמן כדי לייצר עוברים בשלב ההריון הרצוי, לנתח נשים הרות להתאוששות לב שלמה (כולל רקמות הקשורות כגון מערכת הזרימה), קיבעון לב והכנה ל קריוסטט התגובה, בסיסי שיטות היסטולוגיה, ניתוחים כמותיים של מומים לב נפוצות, ניתוח איכותני של compaction שריר הלב, הקודמן משותף פנוטיפים לסוגים מסוימים של CHD.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה בוחן את הטכניקות המעורבות בניתוח של התפתחות הלב בלבבות עובריים. חלק מהמגבלות של שיטה זו הן המיומנות הפיזית הנדרשת עבור טכניקות ההכנה, שעשויות לדרוש תרגול, ומיומנות עם דימות מיקרוסקופ. אם הפרוסות המתקבלות בקריוסטט מלוכלכות, המטאוקסילין והאאוזין כתמים לא יהיו ברורים, או אם התמו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מעבדת אגירי נתמכת על ידי הלב הלאומי, הריאות, ומכון הדם של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת מספר הפרס K01HL135464 ועל ידי איגוד הלב האמריקני תחת מספר הפרס 19IPLOI34660342.
Materials
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J – stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat – Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) – p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
- Kathiresan, S., Srivastava, D. Genetics of human cardiovascular disease. Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).
- Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: The glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Pelech, A. N., Broeckel, U. Toward the etiologies of congenital heart diseases. Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).
- Zaidi, S., Brueckner, M. Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease. Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).
- Kenny, L. A., et al. Transplantation in the single ventricle population. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).
- Navaratnam, D., et al. Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation. The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).
- De Leval, M. R., Deanfield, J. E. Four decades of Fontan palliation. Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).
- Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).
- Jenkins, K. J., et al. Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge – A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young. Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).
- Botto, L. D., et al. Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study. Archives of Disease in Childhood – Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).
- Knowles, R. L., et al. Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects. Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).
- Feng, Y., et al. Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies. Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Liu, Y., et al. Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).
- Kurian, L., et al. Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development. Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).
- Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond. Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).
- Srivastava, D. Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis. Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- . Stage Definition Available from: https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998)
- Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017)
- . Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007)
- MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness. IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).
- Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy. Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).
- Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).
