Analyse von angeborenen Herzfehlern bei Mausembryonen mit qualitativen und quantitativen histologischen Methoden
Summary
In diesem Protokoll beschreiben wir Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse von Entwicklungsphänotypen bei Mäusen, die mit angeborenen Herzfehlern assoziiert sind.
Abstract
Angeborene Herzfehler (CHD) sind die häufigste Art von Geburtsfehler beim Menschen und betreffen bis zu 1% aller Lebendgeburten. Die zugrunde liegenden Ursachen für DIE CHD sind jedoch noch immer schlecht verstanden. Die sich entwickelnde Maus stellt ein wertvolles Modell für die Untersuchung von CHD dar, da kardiale Entwicklungsprogramme zwischen Mäusen und Menschen stark konserviert sind. Das Protokoll beschreibt detailliert, wie Mausembryonen des gewünschten Schwangerschaftsstadiums hergestellt werden können, Methoden zur Isolierung und Erhaltung des Herzens für die nachgeschaltete Verarbeitung, quantitative Methoden zur Identifizierung gängiger CHD-Typen durch Histologie (z. B. ventrikuläre Septum Defekte, vorgerichtliche Septumdefekte, Patent ductus arteriosus) und quantitative Histomorphometriemethoden zur Messung gängiger Muskelverdichtungsphänotypen. Diese Methoden artikulieren alle Schritte, die bei der Probenvorbereitung, -entnahme und -analyse erforderlich sind, sodass Wissenschaftler DIE CHD korrekt und reproduzierbar messen können.
Introduction
CHDs sind die häufigste Art von Geburtsfehler beim Menschen und sind die Hauptursache für Geburtsfehler-bedingte Todesfälle1,2,3,4,5,6. Obwohl etwa 90% der neugeborenen Kinder CHD überleben, wird es häufig mit signifikanter Morbidität und medizinischen Interventionen im Laufe der Jahre verbunden, was eine schwere Belastung für das Leben der Patienten und das Gesundheitssystem7,8,9,10. Außerhalb rein genetischer Faktoren sind die Ursachen der CHD schlecht verstanden4. Unbekannte Ursachen machen 56-66% aller CHD-Fälle nach der American Heart Association und anderen Quellen2,3,4,11. Bekannte Faktoren sind genetische Mutationen, CNVs, de novo Single Nukleotid-Varianten und Aneuploidie. Es wird vermutet, dass Umwelt- und Ernährungsfaktoren auch wichtige Quellen sind, die zur CHD beitragen, wie epidemiologische Studien nahelegen, die den mütterlichen Lebensstil2,12, wirtschaftliche Benachteiligung und Rasse13, und durch die Erforschung von Ernährungsfaktoren wie Folsäure11,14 und die bioaktive Lipid-Retinsäure15,16. Die Untersuchung der Mechanismen und Ursachen von CHD und anderen kardiovaskulären Defekten ist wichtig, um präventive Strategien und neuartige therapeutische Optionen zu entwickeln1,4,17,18,19.
Die sich entwickelnde Maus ist ein Eckpfeiler modellt, um CHD bei Säugetieren zu untersuchen. Einige der angewandten Methoden und Analysen, wie z. B. Sezierungen zur Erhaltung der Herzmorphologie, Analyse von Entwicklungsstadien und Identifizierung von CHD-assoziierten Defekten, können jedoch für Wissenschaftler, die neu in der Analyse muriner Herzen sind, beängstigend sein. Das Ziel der in diesem Protokoll beschriebenen Methoden ist es, qualitative und quantitative Leitlinien für diese Prozesse anzubieten. So erklären wir in diesem Protokoll, wie man zeitnahe Paarungen durchführt, um Embryonen des gewünschten Schwangerschaftsstadiums zu produzieren, schwangere Weibchen für eine intakte Herzregeneration (einschließlich assoziierter Gewebe wie dem Abflusstrakt), Herzfixierung und Kryostatschnitt, grundlegende histologische Methoden, quantitative Analysen von allgemeinen Herzfehlern und qualitative Analyse der Herzmuskelverdichtung, ein häufiger Vorläufer-Phänotyp für einige Arten von KHK.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll untersucht die Techniken, die an der Analyse der Herzentwicklung in embryonalen Herzen beteiligt sind. Einige Einschränkungen dieser Methode sind die erforderliche körperliche Geschicklichkeit für die Vorbereitenden Techniken, die Übung erfordern können, und Geschicklichkeit mit Mikroskop-Bildgebung. Wenn die am Kryostat erhaltenen Scheiben chaotisch sind, die Hämatoxylin- und Eosinfärbung nicht klar ist, oder wenn die am Mikroskop aufgenommenen Bilder eine schlechte Beleuchtung haben, dann funkti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das Aguirre Lab wird vom National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health unter der Nummer K01HL135464 und von der American Heart Association unter der Nummer 19IPLOI34660342 unterstützt.
Materials
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J – stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat – Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) – p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
- Kathiresan, S., Srivastava, D. Genetics of human cardiovascular disease. Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).
- Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: The glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Pelech, A. N., Broeckel, U. Toward the etiologies of congenital heart diseases. Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).
- Zaidi, S., Brueckner, M. Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease. Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).
- Kenny, L. A., et al. Transplantation in the single ventricle population. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).
- Navaratnam, D., et al. Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation. The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).
- De Leval, M. R., Deanfield, J. E. Four decades of Fontan palliation. Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).
- Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).
- Jenkins, K. J., et al. Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge – A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young. Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).
- Botto, L. D., et al. Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study. Archives of Disease in Childhood – Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).
- Knowles, R. L., et al. Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects. Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).
- Feng, Y., et al. Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies. Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Liu, Y., et al. Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).
- Kurian, L., et al. Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development. Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).
- Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond. Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).
- Srivastava, D. Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis. Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- . Stage Definition Available from: https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998)
- Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017)
- . Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007)
- MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness. IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).
- Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy. Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).
- Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).
