Analyse van aangeboren hartafwijkingen in muisembryo's met behulp van kwalitatieve en kwantitatieve histologische methoden
Summary
In dit protocol beschrijven we procedures om ontwikkelingsfenotypes bij muizen geassocieerd met aangeboren hartafwijkingen kwalitatief en kwantitatief te analyseren.
Abstract
Aangeboren hartafwijkingen (CHD) zijn de meest voorkomende vorm van aangeboren afwijking bij de mens, die tot 1% van alle levende geboorten. Echter, de onderliggende oorzaken voor CHD zijn nog steeds slecht begrepen. De ontwikkelende muis vormt een waardevol model voor de studie van CHD, omdat cardiale ontwikkelingsprogramma’s tussen muizen en mensen sterk worden bewaard. Het protocol beschrijft in detail hoe muisembryo’s van het gewenste zwangerschapsstadium kunnen worden geproduceerd, methoden om het hart te isoleren en te behouden voor downstreamverwerking, kwantitatieve methoden om gemeenschappelijke soorten CHD te identificeren door histologie (bijv. ventriculaire septal defecten, atriumseptale defecten, octrooiductus arteriosus), en kwantitatieve histomorfometrie methoden om gemeenschappelijke spierverdichting fenotypes te meten. Deze methoden articuleren alle stappen die betrokken zijn bij monstervoorbereiding, verzameling en analyse, waardoor wetenschappers CHD correct en reproducibly kunnen meten.
Introduction
CHDs zijn de meest voorkomende vorm van aangeboren afwijking bij de mens en zijn de belangrijkste oorzaak van aangeboren afwijking gerelateerde sterfgevallen1,2,3,4,5,6. Hoewel ongeveer 90% van de pasgeboren kinderen CHD overleven, wordt het in de loop der jaren vaak geassocieerd met aanzienlijke morbiditeit en medische ingrepen, die een zware last opleggen voor het leven van de patiënten en het gezondheidszorgstelsel7,8,9,10. Buiten zuiver genetische factoren, zijn de oorzaken van CHD slecht begrepen4. Niet-geïdentificeerde oorzaken zijn goed voor ~ 56-66% van alle CHD gevallen volgens de American Heart Association en andere bronnen2,3,4,11. Bekende factoren zijn genetische mutaties, CV’s, de novo single nucleotide varianten en aneuploïdie. Het vermoeden bestaat dat milieu- en voedingsfactoren ook belangrijke bronnen zijn die bijdragen aan CHD, zoals blijkt uit epidemiologische studies die de levensstijl van moeders met elkaar verbinden2,12, economische ontbering en ras13, en door onderzoek naar voedingsfactoren zoals foliumzuur11,14 en het bioactieve lipideretinoïnezuur15,16. Het onderzoeken van de mechanismen en oorzaken van CHD en andere cardiovasculaire defecten is belangrijk om preventieve strategieën en nieuwe therapeutische optiesteontwikkelen 1,4,17,18,19.
De ontwikkelende muis is een hoeksteenmodel voor het bestuderen van CHD bij zoogdieren. Echter, sommige van de gebruikte methoden en analyses, zoals dissecties behoud van hartmorfologie, analyse van ontwikkelingsstadia, en de identificatie van CHD-geassocieerde gebreken, kan ontmoedigend zijn voor wetenschappers die nieuw zijn voor de analyse van murine harten. Het doel van de in dit protocol beschreven methoden is om kwalitatieve en kwantitatieve richtlijnen voor deze processen aan te bieden. Zo leggen we in dit protocol uit hoe getimede paringen kunnen worden uitgevoerd om embryo’s van het gewenste zwangerschapsstadium te produceren, zwangere vrouwtjes te ontleden voor intact hartherstel (inclusief bijbehorende weefsels zoals het uitstroomkanaal), hartfixatie en voorbereiding cryostat sectioning, basis histologie methoden, kwantitatieve analyses van gemeenschappelijke hartafwijkingen, en kwalitatieve analyse van hartspier verdichting, een gemeenschappelijke voorloper fenotype voor sommige soorten CHD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol onderzoekt de technieken die betrokken zijn bij de analyse van de hartontwikkeling in embryonale harten. Sommige beperkingen van deze methode zijn de vereiste fysieke behendigheid voor de voorbereidende technieken, die oefening kunnen vereisen, en vaardigheid met microscoopbeeldvorming. Als de plakjes verkregen op de cryostat zijn rommelig, de hematoxyline en eosine vlekken zal niet duidelijk zijn, of als de beelden genomen op de microscoop hebben slechte verlichting, dan is de methode die wordt gebruikt met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het Aguirre Lab wordt ondersteund door het National Heart, Lung, and Blood Institute van de National Institutes of Health onder award nummer K01HL135464 en door de American Heart Association onder award nummer 19IPLOI34660342.
Materials
| 15 mL Conical Tube(s) | Fisher Scientific | # 1495970C | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labs | C57BL/6J – stock 000664 | |
| Coplin Staining Jars (x6) | VWR Scientific | # 25457-006 | |
| Coverslips 24X50MM #1.5 | VWR Scientific | # 48393-241 | |
| Cryostat – Leica CM3050S | Leica | N/A | |
| Dissecting Dish(s) | Fisher Scientific | # 50930381 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps (x2) | Fine Science Tools | # 11254-20 | |
| Eosin Y Solution | Millipore Sigma | # HT110116-500ML | |
| Ethyl Alcohol (Pure, 200 proof) | Fisher Scientific | # BP2818-500 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | # E9884-100G | |
| Eukitt | Millipore Sigma | # 03989-100ML | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | # 14060-10 | |
| Fluorescent Stereo Microscope Leica M165 FC | Leica | N/A | |
| Glycine | Millipore Sigma | # 410225-250G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | # 11052-10 | |
| Graphpad Prism 8 Software | Graphpad | ||
| ImageJ Software | ImageJ | ||
| Kimwipes | Fisher Scientific | # 06666A | |
| Mayer's hematoxylin solution | Millipore Sigma | # MHS16-500ML | |
| Micropipette tip(s) – p200 | Fisher Scientific | # 02707448 | |
| Microsoft Excel Software | Microsoft | ||
| OCT Compound | VWR Scientific | # 102094-106 | |
| Olympus CkX53 Microscope | Olympus | ||
| Paint Brushes (at least 2) | |||
| Paraformaldehyde | VWR Scientific | # 0215014601 | Make into 4% solution (dissolved in PBS) |
| Pasteur pipette(s) | Fisher Scientific | # 13-711-7M | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | # 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | # 70011044 | Dilute from 10x to 1x before using |
| Scale | Mettler Toledo | # MS1602TS | |
| Scale | Mettler Toledo | # MS105 | |
| Scalpel Handle #3 | VWR Scientific | # 10161-918 | |
| Scalpel Blades | VWR Scientific | # 21909-612 | |
| Square Mold | VWR Scientific | # 100500-224 | For OCT molds |
| Sucrose | Millipore Sigma | # S9378-500G | |
| Superfrost Plus Slides | Fisher Scientific | # 1255015 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | # 14002-14 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades | VWR Scientific | # 25608-964 | |
| Travel Scale | Acculab | VIC 5101 | |
| Xylene | Millipore Sigma | 214736-1L |
References
- Kathiresan, S., Srivastava, D. Genetics of human cardiovascular disease. Cell. 148 (6), 1242-1257 (2012).
- Sun, R., Liu, M., Lu, L., Zheng, Y., Zhang, P. Congenital Heart Disease: Causes, Diagnosis, Symptoms, and Treatments. Cell Biochemistry and Biophysics. 72 (3), 857-860 (2015).
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: The glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Pelech, A. N., Broeckel, U. Toward the etiologies of congenital heart diseases. Clinics in Perinatology. 32 (4), 825-844 (2005).
- Zaidi, S., Brueckner, M. Genetics and Genomics of Congenital Heart Disease. Circulation Research. 120 (6), 923-940 (2017).
- Kenny, L. A., et al. Transplantation in the single ventricle population. Annals of Cardiothoracic Surgery. 7 (1), 152-159 (2018).
- Navaratnam, D., et al. Exercise-Induced Systemic Venous Hypertension in the Fontan Circulation. The American Journal of Cardiology. 117 (10), 1667-1671 (2016).
- De Leval, M. R., Deanfield, J. E. Four decades of Fontan palliation. Nature Reviews Cardiology. 7 (9), 520-527 (2010).
- Buckberg, G. D., Hoffman, J. I. E., Coghlan, H. C., Nanda, N. C. Ventricular structure-function relations in health and disease: part II. Clinical considerations. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery : Official Journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 47 (5), 778-787 (2015).
- Jenkins, K. J., et al. Noninherited risk factors and congenital cardiovascular defects: Current knowledge – A scientific statement from the American Heart Association Council on Cardiovascular Disease in the Young. Circulation. 115 (23), 2995-3014 (2007).
- Botto, L. D., et al. Lower rate of selected congenital heart defects with better maternal diet quality : a population-based study. Archives of Disease in Childhood – Fetal and Neonatal Edition. 101 (1), F43-F49 (2016).
- Knowles, R. L., et al. Ethnic and socioeconomic variation in incidence of congenital heart defects. Archives of Disease in Childhood. 102 (6), 496-502 (2017).
- Feng, Y., et al. Maternal Folic Acid Supplementation and the Risk of Congenital Heart Defects in Offspring : A Meta-Analysis of Epidemiological Observational Studies. Scientific Reports. 17 (5), 8506 (2015).
- Rhinn, M., Dolle, P. Retinoic acid signalling during development. Development. 139 (5), 843-858 (2012).
- Liu, Y., et al. Circulating retinoic acid levels and the development of metabolic syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (February), 2015 (2016).
- Kurian, L., et al. Identification of novel long noncoding RNAs underlying vertebrate cardiovascular development. Circulation. 131 (14), 1278-1290 (2015).
- Aguirre, A., Sancho-Martinez, I., Izpisua Belmonte, J. C. Reprogramming toward heart regeneration: Stem cells and beyond. Cell Stem Cell. 12 (3), 275-284 (2013).
- Srivastava, D. Making or breaking the heart: from lineage determination to morphogenesis. Cell. 126 (6), 1037-1048 (2006).
- Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
- . Stage Definition Available from: https://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/StageDefinition/stagedefinition.html (1998)
- Part 4-Measure Areas using Thresholding. Science Education Resource Center Available from: https://serc.carleton.edu/eet/measure_sat2/part_4.html (2017)
- . Examples of Image Analysis Using ImageJ Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf (2007)
- MacIver, D. H., Adeniran, I., Zhang, H. Left ventricular ejection fraction is determined by both global myocardial strain and wall thickness. IJC Heart and Vasculature. 1 (7), 113-118 (2015).
- Towbin, J. A., Ballweg, J., Johnson, J. Left Ventricular Noncompaction Cardiomyopathy. Heart Failure in the Child and Young Adult: From Bench to Bedside. , 269-290 (2018).
- Choi, Y., Kim, S. M., Lee, S. C., Chang, S. A., Jang, S. Y., Choe, Y. H. Quantification of left ventricular trabeculae using cardiovascular magnetic resonance for the diagnosis of left ventricular non-compaction: evaluation of trabecular volume and refined semi-quantitative criteria. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 18 (1), 24 (2016).
