生成基于人类 iPSC 的血脑屏障芯片

BBB是一种高度选择性的屏障，将中枢神经系统与循环血液分离。它保护关键的大脑功能免受潜在的破坏性物质，因子和异种生物，同时也允许营养物质和其他代谢物的流入，以保持大脑平衡¹。BBB 是一种多细胞 NVU，其中圆细胞、星形细胞端脚和神经元过程直接接触脑微血管内皮细胞 （BMECs）。这些交互允许 BMEC 形成由紧密和附着点^2、3支持的专用屏障属性。这种屏障的形成限制了分子的准细胞通道，但它含有偏振的传输器，以主动将分子输送到CNS或回到血液^1。由于这些独特的屏障特性，BBB是生物药物输送到大脑的主要障碍，据估计，不到5%的FDA批准的小分子可以达到CNS^4。

动物模型已广泛用于研究BBB渗透和BBB开发中涉及的分子机制^5。虽然动物模型忠实地表现了复杂的多细胞在体内环境，BBB运输者的表情和活性的差异，以及不同物种的基质特异性往往排除了动物数据准确地推断给人类^6。因此，基于人的模型对于研究人类BBB和用于开发针对CNS的药物至关重要。随着生物、人类专用药物在制药开发领域的日益占据主导地位，这种需求变得更加明显。累积的证据表明，受损的BBB与一些严重的中枢神经系统疾病有关，包括脑肿瘤和神经系统疾病^7，8，9。忠实地反映这些疾病的人类模型有可能1）确定可能针对药物开发的新途径，2）预测CNS渗透，从而减少临床前研究的时间和资源，并可能降低临床试验的失败率。

体外模型已被广泛应用，以研究BMEC与NVU其他细胞之间的相互作用，并为潜在的BBB渗透药物¹⁰进行筛选。为了重建人类BBB的关键方面，体外模型必须显示生理相关特性（即，低副细胞渗透性和生理相关的跨端面电阻[TEER]穿过内皮单层）。此外，体外系统的分子轮廓必须包括代表性功能传输系统的表达。通常，体外模型由内皮细胞组成，这些细胞在半渗透膜上与其他NVU细胞的组合共同培养，以增强BBB特性^11。这种方法允许对阻隔功能和分子渗透性进行简单和相对快速的评估。这种基于细胞的BBB模型可以建立与动物或人类细胞源，包括从手术切除或永生BMEC线分离的细胞。

最近，将人类多能细胞分化为BMEC的协议被引入，作为体外人类BBB模型^12、13的诱人来源。诱导多能干细胞（iPSC）衍生的BMECs（iBMECs）具有高度的可扩展性，表现出人类BBB的关键形态和功能特征，并携带患者的遗传学。在文化中，iBMECs 形成一个单层，表示紧密的交汇点标记，并在体内显示类似紧密的交汇点复合物。这些细胞也表达BBB标记，包括BBB葡萄糖转运器，葡萄糖转运器1（GLUT1）。重要的是，与人类BMECs的其他替代细胞源不同，iBMECs获取的屏障特性与在体内¹⁴测量的值一样高，沿巴索边轴极化，并表达功能外泄泵。此外，使用不同科目的 iPSC 1） 欢迎有机会以个性化医学方式测试 BBB 的各个方面，2） 为生成 NVU 的其他细胞类型提供了灵活的来源。从异源细胞源生成这些细胞以产生个性化的BBB芯片也有助于了解药物反应的个体间差异，这是导致抗药性或对临床研究中观察到的治疗反应受损的主要原因。

在盘式或半透射式跨井插入物中，将 iBMEC 用作单层，是 BBB 建模的有力方法。这些系统往往坚固、可重复且经济高效。此外，TEER 和渗透性等功能分析执行起来相对简单。然而，二维（2D）系统无法概括体内组织的3D特性，它们缺乏循环血液和血细胞提供的生理剪切应激力量。这限制了这些模型中血管内皮开发和维护内在BBB特性和功能的能力。

由活细胞排列的微工程系统已经实现，以模型各种器官功能的概念称为器官在芯片上。通过重建体内类似多细胞的架构、组织-组织界面、物理化学微环境和血管灌注，这些微工程平台产生无法与传统的 2D 文化系统。它们还支持高分辨率、实时成像和分析与体内组织和器官环境中的活细胞相似的生化、遗传和代谢特征。然而，芯片上器官的一个特别挑战是，这些微工程芯片的设计、制造和应用需要专业工程专业知识，而这些专业知识在生物学学术实验室中通常缺乏。

我们最近将iPSC和器官芯片技术相结合，生成了^15、16的个性化BBB芯片型号。为了克服上述技术挑战，商用Chip-S1与培养模块一起使用，该仪器旨在以简单可靠的方式自动维护芯片（Emulate Inc.）。BBB芯片再现了神经细胞和内皮细胞之间的相互作用，并实现了生理相关的TEER值，该值由定制的器官芯片与集成的金电极¹⁷测量。此外，BBB芯片显示低副细胞渗透性，响应器官级别的炎症提示，表示活性排泄泵，并表现出可溶性生物标志物和生物药物的预测传输。值得注意的是，由几个人产生的BBB芯片捕获了健康个体与神经系统疾病患者之间的预期功能差异^15。

下面详述的协议描述了一种可靠、高效和可重复的方法，用于在动态流条件下生成基于 iPSC 的 BBB 芯片。提供有关可以直接在 BBB 芯片或从取样流出物中执行的测定和端点分析类型的指导。因此，该协议演示了可用于评估人类相关模型中的生物和功能特性和响应的技术范围。

此处简要介绍了基于 iPSC 的 BBB 芯片。人类iPSC最初在组织培养瓶中作为神经祖体的自由浮动聚集体（称为EZ球体）进行分化和繁殖。芯片-S1^16，18，19的顶部通道被种子与分离的EZ球，形成芯片的”大脑侧”，因为细胞分化在7天的神经祖细胞（iNPCs），iAstrocyt和iNeurons的混合培养。人类 iPSC 在组织培养板中也区分为 iBMEC。芯片的底部通道与iBMECs一起播种，形成”血侧”，形成内皮管（图1）。多孔细胞外基质 （ECM） 涂层膜可分离顶部和底部通道 1），允许通道和 2 之间形成细胞与细胞之间的相互作用，允许用户使用传统的光学显微镜在任一通道中运行渗透性测定和图像单元。