Bir Hücre Tipine Özel Ölçekte Arabidopsis thaliana Kök Gelişimini Araştırmak Için Ribozom Affinity Arınma (TRAP) Çevirisi

Yeni nesil sıralama tekniklerinin giderek artan uygulamasıyla, gelişim biyolojisinde uzamsal çözünürlük artırılabilir. Çağdaş çalışmalar, tek hücreli seviye^,1,2,^3,,4değilse, dokuların özel hücre tiplerine kadar incelenmesini amaçlamaktadır. Bu amaçla, son elli yıl içinde farklı yöntemlerbir bolluk geliştirilmiştir (Şekil 1Abakınız )⁵,^{6,,7,8,9,10,11,12,13,14,15}.

Bitki bilimindeki pek çok araç, hayvan araştırmalarında öncülük eden tekniklerin adaptasyonları olmuştur. Burada ayrıntılı olarak sunduğumuz yöntem için durum böyle değildir. 2005 yılında, protein çevirisi güçlü bir arka plan ile donatılmış, Bailey-Serres Lab sonraki yakınlık saflaştırma¹⁶için ribozomal proteinleri mühendisi yola çıktı. Böylece, bir sakaroz gradyan ile ultracentrifugation dayalı ve 1960’lardan beri ribozomçevirme değerlendirmek için kullanılan zaman alıcı ve emek yoğun polizom profilleme, önlemek olabilir^17,18. Yöntem o zamandan beri çevirisel ribozom afinite arınma (TRAP)¹⁶olarak anılacaktır. Bitkilerde başarılı translatome çalışmalardan sonra, Heiman ve ark. hayvanlar için TRAP adapte¹⁹ ve diğerleri maya^20, Drosophila^21, Xenopus²² ve zebra balığı^23,24.

Model sisteminin genetik modifikasyonu TRAP için bir ön koşul olmasına rağmen, hangi türler genetik dönüşüm için uygun uygulama sınırlar, bir aynı anda özel ilgi ve bozulmamış doku / organ²⁵ izole etmek için son derece zor hücrelerin alt kümeleri hedef bu itiraz koşum olabilir (örneğin, bir fare beyin veya enfekte bitki dokusunda mantar hyphae yüksek dallı dendritik hücreler). Bitkilerde, tüm hücreler hidrostatik iskelet²⁶temelini oluşturan hücre duvarları ile yerinde tutulur. Bu matris bir bitki hücresi serbest etmek için, bilim adamları ya fiziksel lazer yakalama mikrodizeksiyon (LCM)²⁷ veya hücre duvarları²⁸enzimatik sindirim gerçekleştirilen yoluyla çevresindeki doku hücre kesip var . İkinci hücreler arasında, sözde protoplastlar, ilgi popülasyonu floresan etiketli ve floresan aktif hücre sıralama (FACS)⁷ile ayrılabilir. LCM genellikle sabit ve balmumu gömülü bir örnek gerektirir, hangi sonuçta onun RNA kalitesini bozar²⁹. FACS tabanlı yöntemler yüksek kaliteli RNA verim, ancak protoplasting kendisi süreci gen ekspresyonu farklılıkları tanıttı³⁰ ve modifiye ve kalın ikincil hücre duvarları ile dokuların tedavi etmek için kötü üne sahiptir. Ayrıca, bitkilerdeki birçok gelişimsel sürecin mekanik olarak iletilen sinyallere dayandığı varsayılır ve bu nedenle hücre duvarının bütünlüğü büyük önem taşımaktadır^31. Çekirdek seviyesinde hareket ederek hücre izolasyonundan maksatlamak için kısayol kullanan iki yöntem, floresan tarafından aktive edilmiş nükleer sıralama (FANS) ve belirli hücre tiplerinde etiketlenmiş çekirdeklerin izolasyonudur (BOZULMASIN). TRAP olduğu gibi, onlar çekirdekleri işaretlemek için hücre tipine özgü organizatörleri kullanmak, daha sonra sıralama yoluyla zenginleştirilmiş olsun veya aşağı çekmek, sırasıyla^8,15. Tüm bu yaklaşımlar için önemli bir sorun bir doku hücrelerinin alt kümelerinden yeterli RNA malzeme elde etmektir. TRAP hücresel RNA’ların sadece bir kısmını ele geçirirken, numune toplama önemli bir darboğazdır. Bu nedenle, düşük giriş tutarlarından yüksek kaliteli veri üretmek için özellikle hassas kitaplık hazırlama protokolleri gereklidir.

Kuruluşundan bu yana, TRAP ya DNA mikrodizileri ile birlikte kullanılmıştır ya da, sıralama maliyetleri son yıllarda önemli ölçüde düştü gibi, RNA-seq^10,32,33. Sablok ve ark.^34’teincelenmiş çok sayıda araştırma sorusu zaten açıklığa kavuşturulmuştur. Belirli hücre türlerini hedeflemek için farklı organizatörleri birleştirerek teknik çok yönlü olduğu için önümüzdeki yıllarda daha fazla rapor takip edeceğine eminiz. Sonunda, Bu indüklenebilir bir şekilde bile yapılacak, ve birçok biyotik ve abiyotik stres faktörlerine bitkinin reaksiyonu probing ile kombine edilebilir. Ayrıca, istikrarlı transgenik hatları mevcut değildir, kıllı kök ekspresyon sistemleri de başarıyla domates ve medicago^35,36TRAP gerçekleştirmek için kullanılmıştır.

Şekil 1: Ribozom afinite arınma (TRAP) çevirisi “omiks” analiz portföyünü tamamlar. A. Analitik hassasiyet düzeylerini artırmak, aşağı tek hücreli hatta hücre altı çözünürlüğü yöntemleri veya bunların kombinasyonları bir bolluk ile elde edilebilir. Şema bitki ve hayvan alanında şu anda mevcut araçlar alabilen bir genel bakış sağlar. Hücresel çözünürlükte doku toplama lcm veya FACS gibi protokoller ile elde edilebilir, daha sonra standart transkripsime veya polizom profilleme / translatome analizi ile birleştiğinde. TRAP ve INTACT, epitop etiketlemeye dayalı olarak hem doku yakalama hem de RNA izolasyonu entegre ederler. Ancak, INTACT sadece hücre çekirdeklerini örnekler ve bu nedenle, transkripsiyon analizi özel bir durum oluşturur. Küçük bir tavşan simgesi hayvan alanında yeni geliştirilen yöntemleri işaretler: SLAM-ITseq ve Flura-seq izin veren enzim ifade hücrelerde değiştirilmiş uracil üsleri ile yeni doğan RNA metabolik targetting güveniyor iken, Slide-seq hücresel aralığında konumsal bilgi sağlayan DNA barkodları ile kaplı cam slayt kullanır. APEX-seq’da belirli hücre altı bölmelerde RNA örneklemesi için yakınlık etiketleme yaklaşımı izlenir. Özellikle, artan çözünürlük genellikle transgenik malzeme (yıldız) üretimi gerektirir ve bu nedenle bu yöntemler ağırlıklı olarak model türler için kullanılır. TRAP özellikle hücre duvarı (CW) veya mekanik sinyalizasyon ve CW matrisserbest bırakmak zor hücre türleri içeren bitki bilimi çalışmaları için uygundur. B. TRAP prosedürünün ayrıntılı ıslak laboratuvar adımları: Farklı hücre tiplerinde (örn. kök endodermisi) GFP etiketli ribozomal proteini ifade eden fideler Petri kaplarında yedi gün boyunca yetiştirilir ve kök malzemesi yapışma donma ile hasat edilir. Toplam RNA kontrol numunesi, santrifüj yoluyla enkaz peletleme önce homojenize ham ekstresi toplanır. Manyetik anti-GFP boncukimmünenfazla yapmak için temizlenmiş ekstrese eklenir. Kuluçka ve üç yıkama adımından sonra polizomla ilişkili RNA (TRAP/polizom RNA) doğrudan fenol-kloroform ekstraksiyonu ile elde edilir. LCM: lazer yakalama mikrodiseksiyon, FACS / FANLAR: floresan aktif hücre / nükleer sıralama, APEX-seq: mühendislik askorbate peroksidaz dayalı yöntem, INTACT: belirli hücre tiplerinde etiketli çekirdeklerin izolasyonu, SLAM-ITseq: dokuda RNA metabolik sıralama için thiol(SH) bağlı alkylation, Flura-seq: fluorourasil etiketli RNA sıralama (Biorender.com ile oluşturulmuş) Bu rakam daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.

Bu makalenin amacı, TRAP yönteminin ayrıntılı bir açıklamasını sağlamak, kritik adımları vurgulamak ve olası bir kitaplık hazırlama yöntemi için rehberlik sağlamaktır.

Genel bir TRAP deneyi temelde aşağıdaki adımlardan oluşacaktır (ayrıca bkz. Şekil 1B):(1) Ribozom etiketleme yapısının klonlanması, transgenik hat üretimi ve seçimi, tohumların büyümesi ve şişirilmesi, sterilizasyon ve kaplama, stres uygulaması/tedavisi (isteğe bağlı) ve doku hasadı; (2) doku homojenizasyonu ve ham ekstresi temizlenmesi, boncuk yıkama ve immünpurifikasyon ve yıkama adımları da dahil olmak üzere immünsafifikasyon; (3) RNA çıkarma ve kalite değerlendirmesi; ve (4) kütüphane hazırlama.

Arabidopsis kökü bir model bitki olarak piyasaya beri bitki geliştirme çalışma için bir model sistemi olmuştur^37,38. Burada TRAP uygulaması bitki yanal kök gelişimi bağlamında sergilenir. Bitkilerde, tüm kök sisteminin birikimi bu programın yürütülmesine dayanır ve bu nedenle organizmanın hayatta kalması için çok önemlidir³⁹. Arabidopsis’telateral kökler ksilem damarlarının yanında bulunan pericycle dokusundan kaynaklanır ve bu nedenle ksilem direk pericycle (XPP; bkz. Şekil 2C)⁴⁰olarak adlandırılır. Kökün derinliklerinde bulunan bazı XPP hücreleri, kurucu hücre kimliği kazanır ve yerel bir hormonal tetikleyici üzerine, anticlinal^41’işişirerek ve bölerek çoğalmaya başlar. Ancak, sert bir hücre duvarı matris varlığı nedeniyle, bu süreç çevre dokular üzerinde mekanik stres uygular. Özellikle, örten endodermis etkilenir, yanal kök büyüme ekseni şekilde olduğu gibi^42,43,44. Gerçekten de, yeni oluşan primordium örten endodermis hücre yoluyla büyümek zorunda kalacak(Şekil 2C2) korteks ve epidermis hücreleri sadece sonunda ortaya çıkarmak için primordium için kenara itilir^{ise 45,46}. Laboratuarımızda yapılan son çalışmalar, endodermisin peridöngüsündeki çoğalmaya aktif olarak katkıda bulundugunu göstermiştir. Endodermal hormonal sinyalhedefli engelleme XPP hücrelerinde bile ilk bölümü inhibe etmek için yeterlidir⁴⁷. Bu nedenle, pericycle-endodermis iletişim Arabidopsislateral kök gelişimi için çok erken bir kontrol noktası oluşturmaktadır. Ancak bu çapraz konuşmanın nasıl yapıldığı bilinmemektedir. Bu gizemi çözmek için XPP ve endodermal hücreleri hedeflemek için TRAP-seq yaklaşımını seçtik. Lateral kök programında hücreler için zenginleştirmek için, biz ekseksen bir auxin analog uygulayarak hormonal tetikleyici taklit (1-naftaneasetik asit, NAA)⁴⁸, hangi aynı zamanda zamansal lateral kök oluşumunun ilk aşamasıçözmek için izin.