Перевод Рибосома сродство очищения (TRAP) для расследования Arabidopsis thaliana Корневая развития в масштабе типа клеток

Благодаря все более широкому применению методов секвенирования следующего поколения, пространственное разрешение в биологии развития может быть увеличено. Современные исследования направлены на вскрытие тканей вплоть до специализированных типов клеток, если не одноклеточного уровня^1,,2,,3,,4. С этой целью за последние пятьдесят лет было разработано множество различных методов (см. рисунок 1A)^{5,6,6,7,,88,9,,10,,11,,12,,13,,14,,15}.

Многие инструменты в науке о растениях были адаптацией методов, которые были впервые в исследованиях на животных. Это не относится к методу, который мы вводим в деталях здесь. В 2005 году, оснащенный сильным фоном в переводе белка, Лаборатория Бейли-Серрес приступила к разработке рибосомных белков для последующего очищения сродства¹⁶. Таким образом, они могли бы избежать трудоемких и трудоемких полисомного профилирования, которое основано на ультрацентрифугации с градиентом сахарозы и было использовано для оценки перевода рибосом с 1960-х^{годов 17,18}. Метод с тех пор был назван переводной рибосомы очистки сродства (TRAP)¹⁶. После успешных исследований транслатома в растениях, Heiman et al. адаптированы TRAP для животных¹⁹ и другие расширили свое применение дрожжей²⁰, Drosophila²¹, Xenopus²² и зебрафиш^23,24.

Хотя генетическая модификация модельной системы является необходимым условием для TRAP, которая ограничивает ее применение видов, поддавшихся генетической трансформации, можно одновременно использовать это возражение в целевых подмножествах клеток, которые представляют особый интерес и в противном случае чрезвычайно трудно изолировать от нетронутой ткани / органа²⁵ (например, высоко разветвленные дендритные клетки в мозге мыши или грибковых hyphae инфицированных растительных тканей). В растениях все клетки удерживаются на месте через клеточные стенки, которые составляют основу гидростатического скелета^26. Чтобы освободить клетку растений из этой матрицы, ученые либо физически вырезать клетку из окружающей ткани с помощью лазерного захвата микродиссекции (LCM)²⁷ или выполняется ферментативное пищеварение клеточных^{стенок 28}. Среди последних клеток, так называемых протопластов, популяция, интересующая сяртово,констачированная и может быть отделена с помощью флуоресцентной сортировки клеток (FACS)⁷. LCM обычно требует, чтобы образец был исправлен и встроен в воск, что в конечном итоге ухудшает качество его РНК^29. Методы на основе FACS дают высококачественную РНК, но сам процесс протоптертора вводит различия в экспрессии генов^30, а ткани с модифицированными и толстыми вторичными клеточными стенками, как известно, трудно поддаются лечению. Кроме того, многие процессы развития в растениях, как предполагается, полагают, полагаются на механически передаваемые сигналы и, следовательно, целостность клеточной стенки имеет первостепенное значение³¹. Два метода, которые используют ярлык, чтобы обойти изоляцию клеток, работая на уровне ядер, являются флуоресценция активированной ядерной сортировки (FANS) и изоляции ядер помечены в конкретных типах клеток (INTACT). Как и в TRAP, они используют клеточные тип-специфические промоутеры для того чтобы маркировать ядра, которые затем получают обогащенными через сортировать или вытягивать вниз, соответственно^8,,15. Основная проблема для всех этих подходов заключается в том, чтобы получить достаточное количество РНК-материала из подмножества клеток в ткани. Поскольку TRAP захватывает лишь часть клеточных РНК, сбор образцов является значительным узким местом. Поэтому для получения высококачественных данных из низких объемов ввода необходимы особенно чувствительные протоколы подготовки библиотек.

С момента своего создания, TRAP был либо использован в сочетании с ДНК microarrays или, как секвенирование расходы значительно снизились в последние годы, РНК-сек^10,32,33. Множество вопросов исследования уже были выяснены, как рассмотрено в Sablok и др.³⁴. Мы убеждены, что больше докладов будет следовать в ближайшие годы, как техника является очень универсальным при объединении различных промоутеров для целевых конкретных типов клеток. В конце концов, это будет сделано даже в индуцируемой образом, и может быть объединена с зондирования реакции растения на многие биотических и абиотических факторов стресса. Кроме того, там, где стабильные трансгенные линии отсутствуют, волосатые системы экспрессии корней также успешно используются для выполнения TRAP в томате и medicago^35,36.

Рисунок 1: Перевод циризующей сродства рибосомы (TRAP) дополняет портфель анализа “омики”. О. Повышение уровня аналитической точности, вплоть до одноклеточного или даже субклеточного разрешения может быть достигнуто с помощью множества методов или их комбинаций. Схема дает обзор имеющихся в настоящее время инструментов в области растений и животных. Сбор тканей при клеточном разрешении может быть достигнут с помощью таких протоколов, как LCM или FACS, которые затем соединяются со стандартным транскриптомом или полисомным профилированием/анализом транслатома. TRAP и INTACT интегрируют захват тканей и изоляцию РНК, поскольку они основаны на эпитоп-пометке. Тем не менее, образцы INTACT только ядра клеток и представляет собой, следовательно, особый случай анализа транскриптома. Небольшой значок кролика отмечает недавно разработанные методы в области животных: В то время как SLAM-ITseq и Flura-seq полагаются на метаболическое тарзание зарождающихся РНК с модифицированными базами урацила в клетках, выражающих разрешительный фермент, Slide-seq использует стеклянный слайд с покрытием со штрих-кодами ДНК, которые предоставляют позиционную информацию в клеточном диапазоне. В APEX-seq используется подход к маркировке непосредственной маркировки для пробы РНК в конкретных субклеточных отсеках. Примечательно, что повышенное разрешение часто требует генерации трансгенного материала (звездочек), и эти методы, таким образом, в основном используются для типовых видов. TRAP особенно подходит для исследований растительной науки с участием клеточной стенки (CW) или механической сигнализации, а также клеточных видов, которые трудно выпустить из их матрицы CW. B. Детальные шаги влажной лаборатории процедуры TRAP: Рассада, выражающая GFP-тегами рибосомный белок в различных типах клеток (например, корневые эндодермисы), выращиваются на чашках Петри в течение семи дней, а корневой материал собирают путем замораживания оснастки. Общий образец контроля РНК собирается из гомогенизированного сырого экстракта, прежде чем гранулировать мусор с помощью центрифугации. Магнитные бусы анти-GFP добавляются в очищенный экстракт для выполнения иммунопротеберации. После инкубации и трех этапов стирки, полисомо-ассоциированной РНК (TRAP /полисома РНК) непосредственно получается через экстракцию фенола-хлороформа. LCM: лазерный захват микродиссекции, FACS/ FANS: флуоресценция активированной ячейки / ядерной сортировки, APEX-seq: метод, основанный на инженерии аскорбат перекистой, INTACT: изоляция ядер помечены в конкретных типах клеток, SLAM-ITseq: тиол (SH)-связанных алкилирования для метаболического секвенирования РНК в тканях, Flura-seq: фторурацил помечены РНК секвенирования (Создано с Biorender.com) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Целью данной статьи является предоставление подробного описания метода TRAP, выделение критических шагов и руководство по возможному методу подготовки библиотеки.

Общий эксперимент TRAP будет по существу состоять из следующих шагов (см. также Рисунок 1B):(1) Подготовка растительного материала, включая клонирование рибосом-теговая конструкция, трансгенное производство линии и отбор, выращивание и ссыпая семян, стерилизации и покрытия, а также стрессовое применение/обработка (необязательно) и сбор тканей; (2) иммуноочищение, включая гомогенизацию тканей и очистку сырого экстракта, мытье биса и иммуноочищение, и шаги мытья; (3) добыча РНК и оценка качества; и (4) подготовка библиотеки.

Корень Arabidopsis была модельсистемы для изучения развития растений с момента его введения в качестве модели завода^37,38. Здесь применение TRAP демонстрируется в контексте развития бокового корня растений. В растениях, накопление всей корневой системы опирается на выполнение этой программы и поэтому очень важно для выживания организма³⁹. В Arabidopsis, боковые корни происходят из ткани перицикл, который находится рядом с ксилем судов и, следовательно, называется ксилем полюс перицикл (XPP; см. Рисунок 2C)⁴⁰. Некоторые клетки XPP, которые расположены глубоко внутри корня, приобретают идентичность ячейки основателя и, на местном гормональном триггере, начинают размножаться путем отеков и деления антиклинально⁴¹. Однако, из-за наличия жесткой матрицы стенки клетки, этот процесс оказывает механическое давление на окружающие ткани. В частности, поражена надлежащая эндодермис, так как она находится на пути боковой оси роста корня^42,,43,,44. Действительно, вновь формирующихся primordium придется расти через надлежащую клетку эндодермис(Рисунок 2C2) в то время как коры и эпидермиз клетки просто отодвинуты в сторону для приморского,^{наконец,}выйти⁴⁵,⁴⁶. Недавняя работа в нашей лаборатории показала, что эндодермис активно способствует распространению в перицикле. Целенаправленной блокировки эндодермальной гормональной сигнализации достаточно, чтобы ингибировать даже самое первое деление в клетках XPP⁴⁷. Таким образом, перицикл эндодермис связи представляет собой очень ранний контрольно-пропускной пункт для бокового развития корней в Arabidopsis. Это, однако, не известно, как этот перекрестный разговор выполняется. Чтобы разгадать эту тайну, мы выбрали trap-seq подход к целевой XPP и эндодермальных клеток. Чтобы обогатить клетки в боковой корневой программе, мы имитировали гормональный триггер, экзогенно применяя аналог auxin (1-нафталенеацетической кислоты, NAA)⁴⁸, который в то же время позволил временно решить начальную фазу бокового образования корня.