細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

次世代シーケンシング技術の応用の増加によって、発生生物学における空間分解能が増強される可能性があります。現代の研究は、単一細胞レベル^{,,1、2、3、42}ではないにしても、特殊な細胞タイプに組織¹を解剖することを目的としています。³⁴この処理のために、過去 50 年間に多数の異なる方法が考案されています (図1A)⁵、^6、,7,、8 、^9、10^{9、11、12、13、1414、15}.

植物科学の多くのツールは、動物研究で開拓された技術の適応されています。これは、ここで詳しく紹介する方法には当てはまらない。2005年、タンパク質翻訳の強力な背景を備えたBailey-Serres Labは、その後の親和性精製のためにリボソームタンパク質の設計に着手しました^。したがって、スクロース勾配を有する超遠心分離に基づく時間と労力を要するポリソームプロファイリングを回避することができ、1960年代^17、18,18年以来リボソームの翻訳を評価するために使用された。この方法は、その後、翻訳リボソーム親和性精製^(TRAP)16と呼ばれている。植物の翻訳研究に成功した後、Heimanらの動物¹⁹と他の人のためのTRAPを適応させた酵母^20、ショウジョウバエ^21、ゼノプス²²およびゼブラフィッシュ^23、24,24への応用を拡張した。

モデルシステムの遺伝子改変はTRAPの前提条件であり、その適用を遺伝的変換に適した種に限定しますが、この異議を、特別な関心を持ち、無傷の組織/器官²⁵から分離することが非常に困難な細胞のサブセット(例えば、マウス脳内の高度に分岐した樹状細胞または感染した植物組織の真菌性催眠細胞)に同時に利用することができます。植物では、全ての細胞が、静水性骨格²⁶の基礎となる細胞壁を介して所定の位置に保持される。このマトリックスから植物細胞を解放するために、科学者たちはレーザー捕捉マイクロディション(LCM)27を介して周囲の組織から細胞を物理的²⁷に切断するか、または細胞壁²⁸の酵素消化を行った。後者の細胞の中でも、いわゆるプロトプラストは、目的の集団が蛍光標識され、蛍光活性化細胞選別(FACS)7を介して分離することができる⁷。LCMは通常、試料を固定してワックスに埋め込む必要があり、最終的にはRNA²⁹の品質が低下する。FACSベースの方法は高品質のRNAを生み出すが、プロプロトバテナのプロセス自体が遺伝子発現³⁰の違いを導入し、改変された厚い二次細胞壁を有する組織は治療が困難であると悪名高い。さらに、植物における多くの発達過程は機械的に伝達される信号に依存すると仮定され、したがって細胞壁の完全性は最も重要である^31。核のレベルで動作することによって細胞単離を回避するためのショートカットを使用する2つの方法は、蛍光活性化核選別(FANS)および特定の細胞タイプ(INTACT)でタグ付けされた核の単離である。TRAPのように、彼らは細胞型特異的プロモーターを使用して核をマークし、その後、並べ替えまたはプルダウンを介して濃縮され、それぞれ^8,8、15。これらすべてのアプローチの主要な課題は、組織中の細胞のサブセットから十分なRNA材料を得るということです。TRAP は細胞RNAのほんの一部しか捕捉しなかね、サンプル収集は大きなボトルネックです。したがって、特に、低入力量から高品質のデータを生成するためには、機密性の高いライブラリ準備プロトコルが必要です。

その設立以来、TRAPはDNAマイクロアレイと組み合わせて使用されているか、または、シーケンシングコストが近年大幅に低下したため、RNA-seq^{1010、32、3332,33}が使用されている。Sablokら³⁴でレビューされた多数の研究の質問が既に解明されています。我々は、特定の細胞タイプを標的に異なるプロモーターを組み合わせる場合、この技術は非常に汎用性が高いため、今後数年間でより多くの報告が続くと確信しています。最終的には、これは誘導可能な方法でも行われ、多くの生物的および無生物的ストレス要因に対する植物の反応を調査することと組み合わされる可能性があります。さらに、安定したトランスジェニックラインが利用できないところでは、毛深い根発現系もトマトおよびメディカゴ^35,36,36でTRAPを行うためにもうまく使用されている。

図1:リボソームアフィニティー精製(TRAP)の翻訳は、「オミックス」分析ポートフォリオを補完します。A.分析精度のレベルを上げると、単一細胞または細胞内の分解能まで、多くの方法またはそれらの組み合わせによって達成できます。このスキームは、植物および動物分野で現在利用可能なツールの概要を示します。細胞分解能での組織の収集は、LCMやFACSのようなプロトコルによって達成され、標準のトランスクリプトームまたはポリソームプロファイリング/翻訳分析に結合されます。TRAPとINTACTは、エピトープタグに基づいているため、組織捕捉とRNAの分離の両方を統合します。しかしながら、INTACTサンプルは細胞核のみを構成し、したがって、トランスクリプトーム分析の特別な場合を構成する。小さなウサギのアイコンは、動物分野で新たに開発された方法を示しています:SLAM-ITseqとFlura-seqは、寛容な酵素を発現する細胞内の改変ウラシル塩基を持つ新生RNAの代謝ターゲッティングに依存していますが、Slide-seqは、細胞範囲内の位置情報を提供するDNAバーコード付きコーティングガラススライドを使用しています。特定の細胞内区画で RNA をサンプリングするために、APEX-seq では近接標識アプローチが続きます。特に、分解能の向上にはトランスジェニック材料(アスタリスク)の生成が必要なことが多く、モデル種に対してこれらの方法が主に使用される。TRAPは、細胞壁(CW)やメカニックシグナリング、およびCWマトリックスから放出することが困難な細胞種を含む植物科学研究に特に適しています。B. TRAP手順の詳細なウェットラボステップ:異なる細胞タイプ(例えば根内胚葉)でGFPタグ付きリボソームタンパク質を発現する苗は、7日間ペトリ皿で栽培され、根材料はスナップ凍結によって収穫される。全RNA制御サンプルは、遠心分離によって破片をペレットする前に、均質化された粗抽出物から収集されます。磁性抗GFPビーズをクリアした抽出物に添加して、免疫沈降を行います。インキュベートと3つの洗浄工程の後、ポリソーム関連RNA(TRAP/ポリソームRNA)はフェノール-クロロホルム抽出を介して直接得られます。LCM:レーザーキャプチャマイクロディスセクション、FACS/ファン:蛍光活性化細胞/核選別、 APEX-seq:工学的アスコルビンペルオキシダーゼに基づく方法、INTACT:特定の細胞型にタグ付けされた核の単離、SLAM-ITseq:チオール(SH)結合アルキル化組織中のRNAの代謝シーケンシングに対する、Flura-seq:フルオロシル標識RNAシーケンシング(フルオロシル標識RNAシーケンシング Biorender.com)をクリックしてください。

この記事の目的は、TRAP メソッドの詳細な説明を提供し、重要な手順を強調し、可能なライブラリ準備方法のガイダンスを提供することです。

一般的なTRAP実験は、基本的に次のステップで構成されます(図1Bも参照):(1)リボソームタグ構造のクローニング、トランスジェニックラインの生産と選択、種子の成長と増量、ストレス適用/処理(オプション)および組織収穫を含む植物材料の調製。(2)粗抽出物の組織均質化および除去、ビーズ洗浄および免疫精製、および洗浄工程を含む免疫精製;(3) RNA抽出および品質評価(4)図書館の準備。

シロイヌナズナルートは、モデルプラント^37,38として導入されて以来^、38植物開発を研究するモデルシステムとなっています。ここでは、TRAPの適用は植物側面根開発の文脈で紹介される。植物では、全体の根系の蓄積は、このプログラムの実行に依存し、したがって、生物の生存のために非常に重要である³⁹.シロイヌナズナシスでは、横根はxylem血管の隣に存在するペリサイクル組織に由来し、したがってxylem極ペリサイクル(XPP;図2Cを参照⁾⁴⁰と呼ばれます。根の奥深くに位置する一部のXPP細胞は、創始者の細胞の同一性を獲得し、局所ホルモンの引き金に基づいて、反クリン⁴¹を腫脹して分裂させることによって増殖し始める。しかし、硬質細胞壁マトリックスの存在により、このプロセスは周囲の組織に機械的なストレスを与えます。特に、上方の内皮は、根根成長軸^{42、43、44,43,}の邪魔であるように影響を受^ける。実際、新たに形成されたプリモジウムは、上層の内皮細胞(図2C2)を介して成長する必要がありますが、皮質および表皮細胞は、プリモジウムが最終的に^45、46,46を出現させるために脇に押し出されるだけです。私たちの研究室での最近の研究は、内皮が積極的にペリサイクルの増殖に対応するために貢献していることを示しています。内皮ホルモンシグナル伝達の標的遮断は、XPP細胞⁴⁷における非常に最初の分裂を阻害するのに十分である。したがって、ペリサイクル-子宮内皮通信は、シロイヌナズナの横根開発のための非常に初期のチェックポイントを構成する。しかし、このクロストークがどのように行われるかは分かっていません。この謎を解明するために、XPP細胞と内皮細胞を標的とするTRAP-seqアプローチを選択しました。横根プログラムの細胞を濃縮するために、オーキシンアナログ(1-ナフタレ酢酸、NAA)48を外因的に適用することによってホルモントリガーを模倣し、同時に側根形成の⁴⁸初期段階を時間的に解決することを可能にした。