מתרגם הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) כדי לחקור את התפתחות השורש של הספר הבסיסי בקנה מידה ספציפי לסוג תא

מונע על ידי יישום הגוברת של טכניקות רצף הדור הבא, רזולוציה מרחבית בביולוגיה התפתחותית יכול להיות מוגבר. מחקרים עכשוויים מכוונים לניתוח רקמות למטה לסוגי תאים מיוחדים, אם לא ברמה אחת של תא^1,2,3,4. למטרה זו, שפע של שיטות שונות המציאו במשך 50 השנים האחרונות (ראה איור 1a)^{5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}.

כלים רבים במדעי הצמח הינם עיבודים של טכניקות שהיו חלוץ במחקר בעלי חיים. זה לא המקרה לשיטה שאנו מציגים בפרוטרוט כאן. ב 2005, מצויד ברקע חזק בתרגום חלבון, מעבדה ביילי Serres להנדס ריבוזומלי חלבונים עבור האהדה הבאה טיהור¹⁶. לפיכך, הם יכולים להימנע מיצירת פרופיל רב פעמי ומעמיק לעבודה, אשר מבוסס על מעבר באמצעות שיפוע של סוכות ושימש להערכת תרגום הריבוזומים מאז^{שנות ה-60,18}. השיטה מאז המכונה ריבולtional טיהור אהדה (מלכודת)¹⁶. לאחר לימודי העברה מוצלחים בצמחים, מלכודת היימן ואח ‘ לבעלי חיים¹⁹ ואחרים הרחיבו את היישום שלה ל^-20שמרים, דרוסופילה²¹, קסנפוס²² ו-דג זברה^23,24.

למרות השינוי הגנטי של מערכת המודל הוא תנאי מוקדם עבור השמנה, אשר מגביל את היישום שלה מינים הניתנים לטרנספורמציה גנטית, ניתן בו לרתום התנגדות זו כדי למקד את קבוצות המשנה של תאים, כי הם בעלי עניין מיוחד, ובכל זאת קשה מאוד לבודד מן הרקמה בשלמותה/איבר²⁵ (למשל בצמחים, כל התאים מוחזקים במקומם דרך קירות התא היוצרים את הבסיס של שלד הידרוסטטי²⁶. כדי לשחרר תא צמח ממטריקס זה, מדענים יש גם לחתוך פיזית את התא מתוך הרקמה המקיפה שלה דרך לכידת לייזר מיקרוניתוח (LCM)²⁷ או ביצע העיכול אנזימטי של קירות התא²⁸. בין התאים האחרונים, מה שנקרא פרוטואופרציה, האוכלוסייה של העניין היא בעלת תווית בדרך כלל וניתן להפריד באמצעות מיון תא המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית (FACS)⁷. LCM בדרך כלל דורש מדגם להיות קבוע מוטבע שעווה, אשר בסופו של דבר מתדרדר את האיכות של ה-RNA שלה²⁹. FACS מבוססי שיטות להניב RNA באיכות גבוהה, אבל התהליך של protoplasting עצמו מציג הבדלים ביטוי גנים³⁰ ורקמות עם קירות תא משני שונה ועבה הם לשמצה קשה לטפל. כמו-כן, מניחים על תהליכים התפתחותיים רבים בצמחים להסתמך על אותות מכנית ולכן השלמות של קיר התא היא בעלת חשיבות עליונה³¹. שתי שיטות, אשר להשתמש בקיצור דרך לעקוף בידוד התא על ידי הפעלה ברמה של נוקלאושני, הם מיון גרעיני המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית (מאווררים) ובידוד של גרעינים מתויג סוגי תאים ספציפיים (שלמות). כמו במלכודת, הם משתמשים ביזמים ספציפיים לסוג תא כדי לסמן גרעינים, שלאחר מכן לקבל מועשר באמצעות מיון או למשוך למטה, בהתאמה^8,15. האתגר העיקרי עבור כל הגישות הללו היא לקבל די חומר RNA מקבוצות המשנה של תאים ברקמה. כמו המלכודת לוכדת רק חלק של RNAs הסלולר, אוסף לדוגמה הוא צוואר בקבוק משמעותי. לפיכך, דרושות במיוחד פרוטוקולי הכנה לספריה הרגישים כדי להפיק נתונים באיכות גבוהה מכמויות קלט נמוכות.

מאז הקמתה, המלכודת כבר נעשה שימוש בשילוב עם מיקרו מערכים DNA או, כמו עלויות רצף ירד באופן משמעותי בשנים האחרונות, RNA-seq^10,32,33. הרבה שאלות מחקר כבר הובהר כפי שנסקרו בסאבלוק ואח ‘.³⁴. אנחנו משוכנעים כי דוחות יותר יעברו בשנים הקרובים כמו הטכניקה היא מאוד תכליתי בעת שילוב יזמים שונים כדי למקד סוגי תאים ספציפיים. בסופו של דבר, זה ייעשה גם בדרך inducible, והוא עשוי להיות משולב עם בדיקת תגובת הצמח לגורמי סטרס ביוטיים ובין רבים. בנוסף, כאשר קווים הטרנסגניים יציבה אינם זמינים, מערכות שעירות ביטוי השורש יש גם בהצלחה לבצע מלכודת עגבניות ותרופות^35,36.

איור 1: מתרגם הריבוכמה אהדה (השמנה) משלים את תיק הניתוח “omics”. A. הגדלת רמות של דיוק אנליטי, עד תא יחיד או אפילו ברזולוציה subcellular יכול להיות מושגת על ידי שפע של שיטות או שילובים מהם. התוכנית מעניקה סקירה של הכלים הזמינים כעת בתחום הצמח ובעלי החיים. אוסף רקמות ברזולוציה התאית יכול להיות מושגת על ידי פרוטוקולים כמו LCM או FACS, אשר מצמידים לאחר מכן להמרה סטנדרטי או polysome בדיקת פרופיל/translatome. מלכודת ושלמות לשלב לכידת רקמות בידוד RNA כפי שהם מבוססים על התיוג האפיפי. עם זאת, דגימות שלמות רק גרעיני התא ומהווה, לכן, מקרה מיוחד של ניתוח ההמרה. סמל ארנב קטן מסמן שיטות שפותחו לאחרונה בשדה בעלי חיים: בעוד סלאם-itseq ו flura-seq להסתמך על יקוד מטבולית של rnas מחדש עם שינוי אורציל בתאים ביטוי האנזים מאשרני, שקופית-seq עושה שימוש בשקופית זכוכית מצופה עם ברקודים DNA המספקים מידע מיקומני ב הגישה תיוג הקרבה מלווה איפקס-seq כדי לדגום RNAs בתאי subcellular ספציפיים. בעיקר, רזולוציה מוגברת לעתים קרובות דורש את הדור של החומר הטרנסגניים (כוכביות) ושיטות אלה משמשות בעיקר עבור מינים מודל. המלכודת מתאימה במיוחד עבור מדעי הצמח לימודי מעורבים קיר תא (CW) או איתות מכונאי, כמו גם מינים תאים שקשה לשחרר מתוך מטריצה CW שלהם. ב. מפורט שלבי המעבדה הרטובה של הליך המלכודת: השתילים מבטאים חלבון מתויג מסוג gfp בסוגים שונים של תאים (כגון אנדודרסיס שורש) גדלים על מנות פטרי במשך שבעה ימים וחומר שורש שנקטפו על ידי הקפאת ההקפאה. מדגם סה כ בקרת RNA נאסף מתוך תמצית גולמי הומוגניים לפני הפלטינג פסולת באמצעות צנטריפוגה. חרוזים אנטי-GFP מגנטיים נוספים לתמצית נקי לבצע immunoprecipitation. לאחר הדגירה ושלושה צעדים לשטוף, ה-RNA polysome הקשורים (מלכודת/polysome RNA) הוא קיבל ישירות באמצעות כלורופורם פנול-הכלורופורם. LCM: לכידת לייזר מיקרודיסקציה, FACS/אוהדים: תא מופעל על-ידי קרינה פלואורסצנטית/מיון גרעיני, איפקס-seq: שיטה המבוססת על הנדסה ascorbate peroxidase, שלמות: בידוד של גרעינים מתויג סוגי תאים ספציפיים, סלאם-ITseq: thiol (SH)-האלקילציה מקושרת עבור רצף חילוף החומרים של RNA ברקמות, Flura-seq: fluorouracil-התווית ברצף RNA (נוצר עם Biorender.com) אנא לחץ כאן כדי להציג

המטרה של מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של שיטת TRAP, כדי להדגיש שלבים קריטיים ולספק הדרכה לשיטת הכנה לספריה אפשרית.

ניסוי המלכודת הגנרית יהיה למעשה מורכב השלבים הבאים (ראה גם איור 1B): (1) הכנת חומר הצמח כולל שיבוט של ריבוכמה תיוג בניית, הייצור קו טרנסגניים ובחירה, גדל ו bulking של זרעים, עיקור וציפוי, ומתח יישום/טיפול (אופציונלי) ו לקצור רקמות; (2) אימונופיקציה, כולל המגון רקמות וניקוי של תמצית גסה, שטיפת חרוזים ואימונופיקציה, ולשטוף את הצעדים; (3) הערכת הוצאת רנ א ואיכות; ו (4) הכנה לספרייה.

שורש arabidopsis כבר מערכת מודל ללמוד פיתוח הצמח מאז המבוא שלה כמפעל דגם^37,38. כאן, היישום של המלכודת הוא לראווה בהקשר של פיתוח השורש הצמח לרוחב. בצמחים, הצטברות של מערכת השורש כולה מסתמך על ביצוע של תוכנית זו ולכן חשוב מאוד להישרדותו של האורגניזם³⁹. באראידאופזיס, שורשי הצדדיים מקורם ברקמת כלקרום העור השוכנת ליד כלי הדם ולכן הוא כינה את המוט הקרום (xpp; ראה איור 2 ג)⁴⁰. כמה תאים XPP, אשר נמצאים עמוק בתוך השורש, לרכוש זהות תא מייסד, על גורם הורמונלי מקומי, להתחיל להתרבות על ידי נפיחות וחילוק אנטיליבאלי⁴¹. עם זאת, בשל נוכחותם של מטריצת קיר נוקשה התא, תהליך זה מפעילה לחץ מכני על הרקמות הסובבות. בפרט, אנדודראמיס הנמצא במעלה מושפע, כפי שהוא בדרך של ציר צמיחה שורש לרוחב^42,43,44. אכן, החדש הקמתה החדשה יהיה צריך לצמוח דרך התאים האנדודרסטיות האלה (איור 2c2) בעוד תאי הקליפה והאפידרמיס הם רק דחפו הצידה הפריבדיום לבסוף לצאת^45,46. העבודה האחרונה במעבדה שלנו הראתה כי האנדודרסטיות תורמת באופן פעיל כדי להכיל את השגשוג בקרום הלב. חסימה ממוקדת של איתות הורמונלי אנדועורי מספיק כדי לעכב גם את החלוקה הראשונה מאוד בתאים XPP⁴⁷. לפיכך, התקשורת האנדוציציסטית מהווה מחסום מוקדם מאוד לפיתוח השורש הרוחבי בערידרופזיס. עם זאת, לא ידוע כיצד מבוצע הוצלב הזה. כדי לפתור את התעלומה הזאת, אנחנו בחרנו את הגישה השמנה-seq כדי למקד את התאים XPP וכלי העורי. כדי להעשיר את התאים בתוכנית השורש לרוחב, אנו לחקה את הגורם ההורמונלי על ידי החלת באופן שונה היישום מערכת הקלה אנלוגי (1-נפלוג חומצה אצטית, NAA)⁴⁸, אשר באותו זמן מותר לפתור באופן זמני את השלב הראשוני של היווצרות השורש הצדדי.