Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

Angetrieben durch die zunehmende Anwendung von Sequenzierungstechniken der nächsten Generation könnte die räumliche Auflösung in der Entwicklungsbiologie erweitert werden. Zeitgenössische Studien zielen darauf ab, Gewebe bis hin zu spezialisierten Zelltypen, wenn nicht einzellig,^1,2,3,4zu sezieren. Zu diesem Zweck wurde in den letzten fünfzig Jahren eine Vielzahl verschiedener Methoden entwickelt (siehe Abbildung 1A)^{5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}.

Viele Werkzeuge in der Pflanzenwissenschaft waren Anpassungen von Techniken, die in der Tierforschung Pionierarbeit geleistet haben. Dies gilt nicht für die Methode, die wir hier im Detail einführen. Im Jahr 2005, ausgestattet mit einem starken Hintergrund in der Protein-Übersetzung, machte sich das Bailey-Serres Lab daran, ribosomale Proteine für die anschließende Affinitätsreinigung zu entwickeln¹⁶. So konnten sie eine zeitaufwändige und arbeitsintensive Polysomenprofilierung vermeiden, die auf einer Ultrazentrifugation mit einem Saccharosegradienten basiert und seit den 1960er Jahren^17,,18zur Beurteilung der Übersetzen von Ribosomen verwendet wurde. Das Verfahren wird seitdem als translationale Ribosome-Affinitätsreinigung (TRAP)¹⁶bezeichnet. Nach erfolgreichen translatome Studien in Pflanzen, Heiman et al. angepasst TRAP für Tiere¹⁹ und andere erweitert seine Anwendung auf Hefe²⁰, Drosophila²¹, Xenopus²² und Zebrafisch^23,24.

Obwohl die genetische Veränderung des Modellsystems eine Voraussetzung für TRAP ist, das seine Anwendung auf Arten beschränkt, die für die genetische Transformation geeignet sind, kann man diesen Einwand gleichzeitig gegen Zielteilmengen von Zellen nutzen, die von besonderem Interesse sind und ansonsten extrem schwierig sind, sich vom intakten Gewebe/Organ²⁵ zu isolieren (z. B. stark verzweigte dendritische Zellen in einem Maushirn oder Pilzhyphen im infizierten Pflanzengewebe). In Pflanzen werden alle Zellen über Zellwände an Ort und Stelle gehalten, die die Grundlage des hydrostatischen Skeletts²⁶bilden. Um eine Pflanzenzelle aus dieser Matrix zu befreien, haben Wissenschaftler die Zelle entweder durch Lasercapture Microdissection (LCM)²⁷ physisch aus ihrem umgebenden Gewebe geschnitten oder die enzymatische Verdauung der Zellwände durchgeführt²⁸. Unter den letztgenannten Zellen, sogenannten Protoplasten, ist die Interessenpopulation fluoreszierend gekennzeichnet und kann durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)⁷abgetrennt werden. LCM erfordert in der Regel, dass eine Probe fixiert und in Wachs eingebettet wird, was letztlich die Qualität ihrer RNA²⁹verschlechtert. FACS-basierte Methoden liefern hochwertige RNA, aber der Protoplasting-Prozess selbst führt zu Unterschieden in der Genexpression³⁰ und Gewebe mit modifizierten und dicken sekundären Zellwänden sind notorisch schwer zu behandeln. Darüber hinaus wird davon ausgegangen, dass viele Entwicklungsprozesse in Anlagen auf mechanisch übertragenen Signalen beruhen und daher die Integrität der Zellwand von größter Bedeutung ist³¹. Zwei Methoden, die eine Abkürzung verwenden, um die Zellisolation zu umgehen, indem sie auf der Ebene von Nukleii arbeiten, sind fluoreszenzaktivierte nukleare Sortierung (FANS) und Isolierung von Kernen, die in bestimmten Zelltypen (INTACT) markiert sind. Wie in TRAP verwenden sie zelltypspezifische Promotoren, um Kerne zu markieren, die anschließend durch Sortierung angereichert oder heruntergezogen werden, bzw.^8,15. Eine große Herausforderung für all diese Ansätze besteht darin, ausreichend RNA-Material aus Teilmengen von Zellen in einem Gewebe zu erhalten. Da TRAP nur einen Bruchteil der zellulären RNAs erfasst, stellt die Probensammlung einen erheblichen Engpass dar. Daher sind besonders sensible Bibliotheksvorbereitungsprotokolle erforderlich, um qualitativ hochwertige Daten aus geringen Eingabemengen zu erzeugen.

Seit seiner Gründung wurde TRAP entweder in Kombination mit DNA-Mikroarrays oder, da die Sequenzierungskosten in den letzten Jahren deutlich gesunken sind, RNA-seq^10,32,33verwendet. Eine Vielzahl von Forschungsfragen wurde bereits erläutert, wie in Sablok et al.³⁴begutachtet. Wir sind überzeugt, dass in den kommenden Jahren weitere Berichte folgen werden, da die Technik sehr vielseitig ist, wenn verschiedene Promotoren kombiniert werden, um bestimmte Zelltypen anzusprechen. Schließlich, Dies wird auch in einer induzierbaren Weise getan werden, und kann mit Sondierung der Pflanze Reaktion auf viele biotische und abiotische Stressfaktoren kombiniert werden. Darüber hinaus, wo stabile transgene Linien nicht verfügbar sind, wurden haarige Wurzelexpressionssysteme auch erfolgreich verwendet, um TRAP in Tomaten und medicago^35,36durchzuführen.

Abbildung 1: Übersetzen der Ribosomenaffinitätsreinigung (TRAP) ergänzt das Analyseportfolio “omics”. A. Eine Erhöhung der analytischen Präzision bis hin zur einzelligen oder sogar subzellulären Auflösung kann durch eine Vielzahl von Methoden oder Kombinationen davon erreicht werden. Die Regelung gibt einen Überblick über die derzeit verfügbaren Werkzeuge im Pflanzen- und Tierbereich. Die Gewebesammlung bei zellulärer Auflösung kann durch Protokolle wie LCM oder FACS erreicht werden, die dann an Standard-Transkriptom oder Polysomenprofiling/Translatom-Analyse gekoppelt werden. TRAP und INTACT integrieren sowohl die Gewebeabscheidung als auch die RNA-Isolierung, da sie auf Epitop-Tagging basieren. INTACT-Proben stellen jedoch nur Zellkerne dar und stellen daher einen besonderen Fall der Transkriptomanalyse dar. Ein kleines Kaninchensymbol markiert neu entwickelte Methoden im Tierbereich: Während SLAM-ITseq und Flura-seq auf metabolische Targetting von entstehenden RNAs mit modifizierten Uracil-Basen in Zellen setzen, die das freizügige Enzym exemittieren, verwendet Slide-seq einen beschichteten Glasschlitten mit DNA-Barcodes, die Positionsinformationen im Zellbereich liefern. In APEX-seq wird ein Näherungsetikettierungsansatz verfolgt, um RNAs in bestimmten subzellulären Kompartimenten zu testen. Insbesondere erfordert eine höhere Auflösung oft die Erzeugung von transgenem Material (Sternchen) und diese Methoden werden daher überwiegend für Modellarten verwendet. TRAP eignet sich besonders für pflanzenwissenschaftliche Studien mit Zellwand (CW) oder mechanischer Signalisierung sowie Zellarten, die schwer aus ihrer CW-Matrix freigesetzt werden können. B. Detaillierte Nasslaborschritte des TRAP-Verfahrens: Sämlinge, die GFP-markiertes ribosomales Protein in verschiedenen Zelltypen (z.B. Wurzelendodermis) exzessieren, werden sieben Tage lang auf Petrischalen angebaut und Wurzelmaterial durch Snap Freezing geerntet. Aus dem homogenisierten Rohextrakt wird eine vollständige RNA-Kontrollprobe entnommen, bevor die Trümmer mittels Zentrifugation granuliert werden. Magnetische Anti-GFP-Perlen werden dem gelöschten Extrakt hinzugefügt, um Immunpräzipitation durchzuführen. Nach Inkubation und drei Waschschritten wird die polysome-assoziierte RNA (TRAP/Polysome RNA) direkt über die Phenol-Chlor-Form-Extraktion erhalten. LCM: Lasercapture Mikrodissektion, FACS/FANS: fluoreszenzaktivierte Zell-/Kernsortierung, APEX-seq: Methode basierend auf der entwickelten Ascorbatperoxidase, INTACT: Isolierung von Kernen, die in bestimmten Zelltypen getaggt sind, SLAM-ITseq: Thiol(SH)-verknüpfte Alkylierung zur metabolischen Sequenzierung von RNA im Gewebe, Flura-seq: fluorouracil-markierte RNA-Sequenzierung (Created with Biorender.com)

Das Ziel dieses Artikels besteht darin, eine detaillierte Beschreibung der TRAP-Methode bereitzustellen, kritische Schritte hervorzuheben und Anleitungen für eine mögliche Bibliotheksvorbereitungsmethode bereitzustellen.

Ein generisches TRAP-Experiment besteht im Wesentlichen aus den folgenden Schritten (siehe auch Abbildung 1B):(1) Vorbereitung von Pflanzenmaterial einschließlich Klonen von Ribosomen-Tagging-Konstrukt, transgener Linienproduktion und -auswahl, Anbau und Füllstoffe von Saatgut, Sterilisation und Beschichtung sowie Stressanwendung/-behandlung (optional) und Gewebeernte; (2) Immunreinigung einschließlich Gewebehomogenisierung und Reinigung des Rohextrakts, Perlenwäsche und Immunreinigung sowie Waschschritte; (3) RNA-Extraktion und Qualitätsbewertung; und (4) Bibliotheksvorbereitung.

Die Arabidopsis-Wurzel ist seit ihrer Einführung als Modellpflanze ein Modellsystem zur Erforschung der Pflanzenentwicklung^37,38. Hier wird die Anwendung von TRAP im Kontext der Pflanzen-Lateralwurzelentwicklung präsentiert. Bei Pflanzen beruht der Aufbau des gesamten Wurzelsystems auf der Durchführung dieses Programms und ist daher sehr wichtig für das Überleben des Organismus³⁹. Bei Arabidopsisstammen laterale Wurzeln aus Pericycle-Gewebe, das sich neben Xylemgefäßen befindet und daher als Xylempol-Pericycle (XPP; siehe Abbildung 2C)⁴⁰bezeichnet wird. Einige XPP-Zellen, die sich tief in der Wurzel befinden, erhalten eine Gründerzellidentität und beginnen sich nach einem lokalen hormonellen Auslöser durch Schwellung und Spaltung antiklinal⁴¹zu vermehren. Aufgrund des Vorhandenseins einer starren Zellwandmatrix übt dieser Prozess jedoch mechanische Belastung der umgebenden Gewebe aus. Insbesondere ist die darüber liegende Endodermis betroffen, da sie sich im Weg der seitlichen Wurzelwachstumsachse^42,43,44befindet. Tatsächlich muss das sich neu formende Primordium durch die darüber liegende Endodermis-Zelle wachsen (Abbildung 2C2), während Kortex- und Epidermiszellen gerade beiseite geschoben werden, damit das Primordium schließlich^45,46entsteht. Jüngste Arbeiten in unserem Labor haben gezeigt, dass die Endodermis aktiv dazu beiträgt, die Proliferation im Pericycle zu bewältigen. Gezielte Blockierung der endodermalen hormonellen Signalisierung reicht aus, um auch die erste Division in den XPP-Zellen⁴⁷zu hemmen. Daher stellt die Pericycle-Endodermis-Kommunikation einen sehr frühen Checkpoint für die laterale Wurzelentwicklung in Arabidopsisdar. Es ist jedoch nicht bekannt, wie dieser Übersprechen durchgeführt wird. Um dieses Geheimnis zu lüften, haben wir den TRAP-seq-Ansatz gewählt, um XPP- und Endodermale Zellen anzuvisieren. Um uns für Zellen im lateralen Wurzelprogramm anzureichern, imitierten wir den hormonellen Auslöser, indem wir exogen ein Auxin-Analog (1-Naphthalenesessigsäure, NAA)⁴⁸auftragen, das gleichzeitig erlaubte, die Anfangsphase der lateralen Wurzelbildung zeitlich aufzulösen.