ترجمة تنقية التقارب الريبوسم (TRAP) للتحقيق في تطوير جذر Arabidopsis thaliana على مقياس نوع الخلية الخاصة

وبدافع من التطبيق المتزايد لتقنيات التسلسل من الجيل التالي، يمكن زيادة الاستبانة المكانية في البيولوجيا الإنمائية. تهدف الدراسات المعاصرة إلى تشريح الأنسجة وصولاً إلى أنواع الخلايا المتخصصة، إن لم يكن بخلية واحدة المستوى^{1،,2،,3،,4.} ولتحقيق هذه الغاية، تم ابتكار عدد كبير من الطرق المختلفة على مدى السنوات الخمسين الماضية (انظر الشكل 1A)^{5،6،7،8،9،10،11،12،13،14،15}.

وقد تم العديد من الأدوات في علم النبات التكيف من التقنيات التي كانت رائدة في مجال البحوث الحيوانية. وليس هذا هو الحال بالنسبة للطريقة التي نقدمها بالتفصيل هنا. في عام 2005، مجهزة خلفية قوية في ترجمة البروتين، مختبر بيلي سيريس المنصوص عليها لهندسة البروتينات riبوم لتنقية تقارب لاحقة¹⁶. وهكذا، فإنها يمكن أن تجنب التنميط متعدد السمات تستغرق وقتا طويلا وكثيفة العمالة، والذي يقوم على ultracentrifugation مع تدرج السكروز وكان يستخدم لتقييم ترجمة الريبوسوم منذ 1960s^17،18. ومنذ ذلك الحين يشار إلى الأسلوب على أنه تنقية تقارب الريبوسرية الانتقالية (TRAP)^16. بعد نجاح دراسات الترجمة في النباتات، Heiman وآخرون تكييفها TRAP للحيوانات¹⁹ وغيرها وسعت تطبيقها إلى الخميرة^20، Drosophila^21، زينوبوس²² وحمار وحشي^23،24.

على الرغم من أن التعديل الجيني للنظام النموذجي هو شرط أساسي لـ TRAP ، الذي يحد من تطبيقه على الأنواع القابلة للتحول الوراثي ، يمكن للمرء في الوقت نفسه تسخير هذا الاعتراض لاستهداف مجموعات فرعية من الخلايا ذات أهمية خاصة ويصعب للغاية عزلها عن الأنسجة السليمة / الجهاز²⁵ (على سبيل المثال ، الخلايا التشفية المتفرعة للغاية في دماغ فأر أو الهيفاي الفطري في الأنسجة النباتية المصابة). في النباتات ، يتم الاحتفاظ بجميع الخلايا في مكانها عبر جدران الخلايا التي تشكل أساس الهيكل العظمي الهيدروستاتيكي^26. لتحرير خلية نباتية من هذه المصفوفة ، قام العلماء إما بقطع الخلية فعليًا من الأنسجة المحيطة بها من خلال إجراء عملية إزالة الميكروبات بالليزر (LCM)²⁷ أو إجراء هضم أنزيمي لجدران الخلية²⁸. من بين الخلايا الأخيرة، ما يسمى protoplasts، يتم تسمية السكان من الفائدة الفلورسنت ويمكن فصلها عن طريق فرز الخلايا المنشط ة الفلورية (FACS)⁷. LCM يتطلب عادة عينة لتكون ثابتة وجزءا لا يتجزأ من الشمع، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى تدهور نوعية الحمض النووي الريبي^29. الأساليب المستندة إلى FACS تنتج الحمض النووي الريبي عالي الجودة ، ولكن عملية protoplasting نفسها تدخل اختلافات في التعبير الجيني³⁰ والأنسجة ذات جدران الخلايا الثانوية المعدلة والسميكة من الصعب علاجها. وعلاوة على ذلك، يفترض العديد من العمليات التنموية في النباتات أن تعتمد على إشارات تنتقل ميكانيكيا، وبالتالي سلامة جدار الخلية ذات أهمية قصوى³¹. طريقتان، تستخدمان اختصاراً للتحايل على عزل الخلايا من خلال العمل على مستوى النوى، هما الفرز النووي المنشط للفلورسينس (FANS) وعزل النوى الموسومة بأنواع خلايا محددة (INTACT). كما هو الحال في TRAP ، فإنها تستخدم المروجين نوع الخلية الخاصة لوضع علامة على النوى ، التي تحصل في وقت لاحق إثراء عن طريق الفرز أو سحب إلى أسفل ، على التوالي^8،15. التحدي الرئيسي لجميع هذه النهج هو الحصول على ما يكفي من المواد الحمض النووي الريبي من مجموعات فرعية من الخلايا في الأنسجة. كما يلتقط TRAP سوى جزء صغير من الحمض النووي الريبي الخلوي، جمع عينة هو عنق الزجاجة كبيرة. ولذلك، هناك حاجة إلى بروتوكولات إعداد المكتبة الحساسة بشكل خاص لإنتاج بيانات عالية الجودة من كميات مدخلات منخفضة.

منذ إنشائها، وقد استخدمت TRAP إما في تركيبة مع microarrays الحمض النووي أو، كما انخفضت تكاليف التسلسل بشكل كبير في السنوات الأخيرة، RNA-seq^10،32،33. وقد تم بالفعل توضيح العديد من الأسئلة البحثية كما تمت مراجعتها في Sablok et al.^34. ونحن مقتنعون بأن المزيد من التقارير ستتبع في السنوات المقبلة كما تقنية متعددة جدا عند الجمع بين المروجين مختلفة لاستهداف أنواع محددة من الخلايا. في نهاية المطاف، سيتم ذلك حتى بطريقة لا يمكن اختزالها، ويمكن دمجها مع التحقيق في رد فعل النبات على العديد من عوامل الإجهاد الحيوي واللاأحيائي. بالإضافة إلى ذلك ، حيث لا تتوفر خطوط معدلة مستقرة ، تم استخدام أنظمة التعبير عن الجذر المشعر بنجاح أيضًا لتنفيذ TRAP في الطماطم وmedicago^35،36.

الشكل 1: ترجمة تنقية التقارب الريبوسومي (TRAP) تكمل محفظة تحليل “omics”. A. يمكن تحقيق زيادة مستويات الدقة التحليلية، وصولا إلى وحدة واحدة أو حتى دقة تحت الخلية من خلال عدد كبير من الأساليب أو تركيبات منها. ويقدم هذا المخطط لمحة عامة عن الأدوات المتاحة حاليا في المجال النباتي والحيواني. يمكن تحقيق جمع الأنسجة في دقة الخلوية من خلال بروتوكولات مثل LCM أو FACS ، والتي يتم اقترانها بعد ذلك بالنسخ القياسي أو تحليل التنميط / الترجمة المتعدد. TRAP وسليمة دمج كل من التقاط الأنسجة وعزل الحمض النووي الريبي لأنها تقوم على العلامات epitope. ومع ذلك ، عينات سليمة نواة الخلية فقط ويشكل ، وبالتالي ، حالة خاصة من تحليل النسخ. رمز أرنب صغير علامات الأساليب المطورة حديثا في مجال الحيوان: في حين أن SLAM-ITseq وFlura-seq تعتمد على التتار الأيضي من الحمض النووي الريبي الوليد مع قواعد uracil المعدلة في الخلايا التي تعبر عن الإنزيم المتساهل، الشريحة-seq يجعل استخدام شريحة الزجاج المغلفة مع الباركود الحمض النووي التي توفر المعلومات الموضعية في النطاق الخلوي. ويتبع نهج وضع علامات القرب في APEX-seq لأخذ عينات RNAs في مقصورات دون خلوية محددة. وتجدر الإشارة إلى أن زيادة الاستبانة كثيرا ما تتطلب توليد مواد معدلة وراثيا (علامات نجمية) ومن ثم تستخدم هذه الأساليب في الغالب للأنواع النموذجية. TRAP مناسب بشكل خاص لدراسات علوم النبات التي تنطوي على جدار الخلايا (CW) أو إشارات ميكانيكية وكذلك أنواع الخلايا التي يصعب إطلاقها من مصفوفة CW الخاصة بهم. ب. مفصلة الخطوات الرطب مختبر الإجراء TRAP: تزرع الشتلات التي تعبر عن بروتين riبوم الموسومة GFP في أنواع الخلايا المتميزة (مثل endodermis الجذر) على أطباق بيتري لمدة سبعة أيام والمواد الجذرية التي يتم حصادها عن طريق تجميد المفاجئة. يتم جمع عينة التحكم في الحمض النووي الريبي بالكامل من مستخلص النفط الخام المتجانس قبل أن يُسقط الحطام عن طريق الطرد المركزي. يتم إضافة الخرز المغناطيسي المضاد لـ GFP إلى المستخلص المنفّر لإجراء الترسيبات المناعي. بعد الحضانة وثلاث خطوات غسل ، يتم الحصول على الحمض النووي الريبي المرتبط بالبولي بعض (TRAP / POLYsome RNA) مباشرة عن طريق استخراج الفينول الكلوروفورم. LCM: الليزر التقاط microdissection، FACS / FANS: خلية تنشيط الفلورسينس / الفرز النووي، APEX-seq: طريقة تقوم على ascorbate peroxidase المهندسة، سليمة: عزل النوى الموسومة في أنواع خلايا محددة، SLAM-ITseq: thiol (SH) المرتبطة alkylation لتسلسل التمثيل الغذائي من الجيش الملكي النيبالي في الأنسجة، فلورا-seq: فلوروراسيل المسمى تسلسل الحمض النووي الريبي (خلق مع Biorender.com) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الهدف من هذه المقالة هو توفير وصف مفصل لأسلوب TRAP، لتسليط الضوء على الخطوات الهامة وتوفير التوجيه لأسلوب إعداد مكتبة ممكن.

وستتألف تجربة TRAP العامة أساسا من الخطوات التالية (انظر أيضا الشكل 1باء):(1) إعداد المواد النباتية بما في ذلك استنساخ بناء العلامات الريبوسومية، وإنتاج الخطوط المحورة وراثيا واختيارها، وتزايد البذور والطلاء وستكثرها، وتطبيق/معالجة الإجهاد (اختياري) وحصاد الأنسجة؛ (2) إعداد المواد النباتية بما في ذلك استنساخ الريبوسوم يُحدّد البناء، وإنتاج الخطوط المحورة وراثيا واختيارها، وزراعة البذور والطلاء وستكثرها، وتطبيق/معالجة الإجهاد (اختياري) وحصاد الأنسجة؛ (2) إعداد المواد النباتية بما في ذلك استنساخ الريبوسوم لوضع العلامات على الخلايا. (2) التنقية المناعية بما في ذلك تجانس الأنسجة وتطهير مستخلص النفط الخام، وغسل النحل وتنقية المناعة، وخطوات الغسيل؛ (3) استخراج الحمض النووي الريبي وتقييم الجودة؛ و(4) إعداد المكتبة.

وقد جذر Arabidopsis نظام نموذجي لدراسة تطوير النبات منذ عرضه كمصنع نموذجي^37,38. هنا ، يتم عرض تطبيق TRAP في سياق تطوير الجذر الجانبي النباتي. في النباتات ، يعتمد تراكم نظام الجذر بأكمله على تنفيذ هذا البرنامج وبالتالي فهو مهم جدًا لبقاء الكائن الحي³⁹. في Arabidopsis، تنشأ الجذور الجانبية من أنسجة الدراجة المحيطة التي تتواجد بجوار أوعية xylem وبالتالي يطلق عليها اسم xylem pole pericycle (XPP ؛ انظر الشكل 2C)⁴⁰. بعض خلايا XPP ، والتي تقع في عمق الجذر ، والحصول على هوية الخلية مؤسس ، وعلى الزناد الهرمونية المحلية ، والبدء في الانتشار عن طريق تورم وتقسيم anticlinally^41. ومع ذلك ، بسبب وجود مصفوفة جدار الخلية جامدة ، وهذه العملية تمارس الإجهاد الميكانيكي على الأنسجة المحيطة بها. على وجه الخصوص ، يتأثر endodermis التجاوزي ، كما هو الحال في طريق محور نمو الجذر الجانبي^42،43،44. في الواقع ، فإن تشكيل بريمورديوم حديثا يجب أن تنمو من خلال الخلية endodermis المبالغ فيها(الشكل 2C2)في حين يتم دفع الخلايا القشرة والبشرة جانبا لprimordium لتظهر أخيرا^45،46. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة في مختبرنا أن endodermis يساهم بنشاط لاستيعاب انتشار في pericycle. حظر المستهدفة من الإشارات الهرمونية endodermal كافية لمنع حتى الانقسام الأول جدا في خلايا XPP⁴⁷. وبالتالي، الاتصالات pericycle-endodermis يشكل نقطة تفتيش مبكرة جدا لتطوير الجذر الجانبي في Arabidopsis. ومع ذلك، لا يُعرف كيف يتم تنفيذ هذا الكلام المتقاطع. لكشف هذا اللغز، اخترنا نهج TRAP-seq لاستهداف XPP والخلايا endodermal. لإثراء للخلايا في برنامج الجذر الجانبي، ونحن تحاكي الزناد الهرموني عن طريق تطبيق خارجي تناظرية الأوكسين (1-حمض النفتاليناستيك، NAA)^48،والتي سمحت في الوقت نفسه لحل مؤقتا المرحلة الأولية من تشكيل الجذر الجانبي.