In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

1. C. elegans entretien et culture Cultivez et synchronisez les colonies de vers à leur quatrième stade de larves (L4) suivant les procédures de laboratoirestandard 8. Le jour de l’expérience IV-FPOP, laver les vers L4 des pelouses bactériennes (OP50 E. coli) avec tampon M9 (0,02 M KH2PO4, 0,08 M Na2HPO4, 0,08 M NaCl, 1 mM MgSO4). Obtenez 500 aliquots de 10 000 vers par échantillon IV-FPOP. 2. Assemblage du système de débit microfluidique Démarrer l’assemblage du système d’écoulement en coupant un morceau de propylène fluoré de 2 cm (FEP) tubing (1/16 po. diamètre externe (o.d.) x 0,020 po. diamètre intérieur (c.-à-d.)). À l’aide d’une aiguille de dissection propre, élargir l’i.d. de la tuyauterie FEP afin de faire un petit cratère à une extrémité seulement, 50 mm de longueur. Le cratère devrait être assez grand pour s’adapter à deux morceaux de silice fusionnée de 360 m.REMARQUE : N’élargissez pas l’extrémité opposée car cette extrémité ne sera utilisée que pour s’adapter au capillaire de sortie. À l’aide d’un coupeur en céramique, couper deux morceaux de 15 cm de 250 m i.d. de la silice fusionnée. Ces deux pièces deviendront les lignes d’infusage du système de débit. À l’aide de ruban adhésif auto-adhésif, enregistrez les deux capillaires i.d. de 250 m ensemble, en veillant à ce qu’ils soient parallèles les uns aux autres et que leurs extrémités soient rincées à 100 %.REMARQUE : Pour s’assurer que les extrémités de silice fusionnées ne sont pas écrasées après la coupe, et sont droites et 100% rincées les unes contre les autres, il est recommandé de les examiner à l’aide d’une loupe ou sous un microscope stéréo. Insérez les deux capillaires scotchés dans le cratère fait main de la tuyauterie FEP. Poussez les capillaires jusqu’au bord même du cratère fait main.CAUTION: Pour maintenir l’efficacité du système d’écoulement, ne poussez pas au-delà du cratère fait main(figure 1a). Déposer un petit point de résine époxy sur une surface propre et mélanger avec une aiguille disséquante. Rapidement, à l’aide de la même aiguille, placez une petite goutte de résine à l’extrémité des capillaires infusants où ils se connectent avec le tube FEP et laissez la résine sécher, suspendre le côté de sortie vers le haut, pendant quelques minutes (figure 1a). Pendant que la résine sèche, liant les tubes FEP et deux capillaires ensemble, couper un nouveau capillaire i.d. de 250 m. Le nouveau capillaire deviendra le capillaire de sortie du système d’écoulement. La longueur désirée du capillaire peut être calculée à l’aide de l’équation ci-dessous :Là où j’ai la longueur du capillaire à couper en centimètres, t est le temps de réaction désiré en quelques minutes, f est le taux d’écoulement en mL/min, et i.d. est le diamètre interne du capillaire en centimètres.REMARQUE : Après avoir coupé le capillaire de sortie, examinez les extrémités en s’assurant qu’elles sont droites et non écrasées. Une fois la résine séchée, insérez le nouveau capillaire à travers l’extrémité de sortie de tubes FEP. Les extrémités intérieures du capillaire de sortie et les deux capillaires d’infusage doivent être flush contre l’autre à l’intérieur de la tuyauterie FEP, ce qui crée le mélange-T (figure 1b). Lier les tubes capillaires et FEP avec de la résine époxy fraîche telle qu’elle est décrite dans les étapes 2.6 et 2.7. Laisser sécher la résine pendant la nuit en liant le système d’écoulement ensemble. Configurez le système de débit microfluidique le lendemain(figure 1c). 3. Système de débit microfluidique pour in vivo FPOP Insérez quatre agitateurs magnétiques à l’intérieur d’une seringue de 5 ml. Cette seringue devient la seringue de l’échantillon. Les agitateurs magnétiques empêchent les vers de s’installer à l’intérieur de la seringue pendant IV-FPOP(figure 2A). Remplir les deux seringues de 5 ml de M9. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air à l’intérieur de chaque seringue car elles peuvent affecter le débit et l’efficacité du mélange. Connectez un adaptateur Luer à chaque seringue de 5 ml pour vous assurer qu’elles sont serrées au doigt et fixées en place. Fixez chaque seringue à une seule soupape 3-2. La seringue doit être fixée au port moyen de la vanne(figure 2B). Fixer chaque seringue de 5 ml à la double pompe à seringue et ajuster le collier d’arrêt mécanique pour éviter une pression excessive sur la seringue du bloc de poussoir. Gardez à l’esprit l’ajout des agitateurs magnétiques lors de la mise du collier d’arrêt. Fixez chaque extrémité capillaire infusante du système de débit microfluidique maison au port supérieur de chaque valve 3-2 à l’aide d’une noix super sans flange, manchon FEP, et ferrule super sans flange(figure 2B). Au port ouvert restant de la soupape 3-2 (port inférieur), attachez un capillaire de 10 cm 450 m i.d. à l’aide d’une noix super sans flange, d’une manchon FEP et d’une ferrule super sans flanges(figure 2B). Ces capillaires deviennent les capillaires d’échantillon de retrait. Démarrez le débit de la pompe et vérifiez toutes les connexions du système de débit microfluidique pour les fuites visuelles. Flux au moins trois volumes de seringues à l’aide du débit expérimental. Le débit final dépend de la fenêtre d’irradiation laser, de la fréquence laser et d’un volume de fraction zéro exclusion.REMARQUE : Pour ce protocole, un débit final de 375,52 l/l/min a été calculé à partir d’une fenêtre d’irradiation laser de 2,55 mm, 250 m i.d. silice fusionnée, fraction zéro exclusion et fréquence de 50 Hz. Le chemin d’écoulement est marqué par les flèches sur la poignée de soupape 3-2. Chaque seringue peut être remplie manuellement en déplaçant la poignée de la soupape de la position d’expulsion à la position de retrait.REMARQUE : Les fuites à la soupape 3-2 peuvent être corrigées en re-screwing la noix super sans flange ou en remplaçant l’une des connexions de valve (écrou super sans flange, manche FEP, ou ferrule super sans flange). Les fuites au mélange-T nécessitent un réassemblage du système de débit microfluidique (étapes 2.1 à 2.11). Déplacez le système de débit microfluidique vers le banc expérimental et fixez le capillaire de sortie à l’étape rayonnante à l’aide d’un syndicat en acier inoxydable de 360 m(figure 2C,D). À l’aide d’un briquet à longue portée, brûlez le revêtement de la silice fondue à la fenêtre d’irradiation laser. Nettoyer le revêtement brûlé à l’aide de tissus sans peluche et de méthanol.REMARQUE : Alternez entre les cycles de combustion et les cycles de nettoyage du méthanol pour éviter de surchauffer le capillaire car l’excès de chaleur peut fondre et/ou casser le capillaire. Placez le bloc d’agitateur magnétique au-dessus de la seringue de 5 ml contenant les agitateurs magnétiques. Ajuster la vitesse et la position du bloc d’agitateur magnétique de sorte que les agitateurs magnétiques à l’intérieur de la seringue de 5 ml tournent lentement et constamment. 4. In vivo FPOP Allumez le laser KrF excimer et laissez le thyratron s’échauffer.CAUTION: Le laser émet un rayonnement visible et invisible à 248 nm longueur d’onde qui peut endommager les yeux. Une protection oculaire appropriée doit être portée avant d’allumer le laser et d’ouvrir la fenêtre de sortie du faisceau. Mesurez l’énergie laser à une fréquence de 50 Hz pour au moins 100 impulsions en plaçant le capteur optique à la fenêtre de sortie du faisceau.REMARQUE : Pour ce protocole, une fenêtre d’irradiation de 2,55 mm a été utilisée avec une énergie laser de 150 à 2,32 mJ. Obtenez approximativement 10 000 vers (500 ll) et retirez manuellement l’échantillon dans la seringue de l’échantillon. Remplissez la seringue de l’échantillon de 2,5 ml de tampon M9 pour un volume d’échantillon final de 3 ml. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est introduite dans la seringue de l’échantillon. Remplissez la deuxième seringue de 3 ml de H2O2de 2 mM, en veillant à nouveau à ce qu’aucune bulle d’air ne soit introduite dans la seringue. À la fin du capillaire de sortie, placez un tube conique de 15 mL enveloppé dans une feuille d’aluminium contenant 6 ml de N’-Dimethylthiourea (DMTU), 40 mM N-tert-Butyl–phenylnitrone (PBN), et 1% de sulfoxide de diméthylyl pour éteindre l’excès H2O2, hydroxique radical, et inhibent l’activité de réductase de sulfoxide de méthionine, respectivement. Démarrez le laser excimer de la fenêtre logicielle, attendez la première impulsion et démarrez le flux de l’échantillon à partir de la double seringue.REMARQUE : Les échantillons doivent être exécutés en doublons biologiques dans des triplicates techniques dans des conditions de 3 échantillons : irradiation laser avec H2O2 (échantillon), absence d’irradiation laser avec H2O2 et pas d’irradiation laser no H2O2 (contrôles), totalisant 9 échantillons par ensemble biologique. Recueillir l’échantillon entier dans le tube de 15 ml, tout en surveillant activement le flux de l’échantillon pour toute fuite visuelle, car une certaine pression arrière de la seringue de l’échantillon peut parfois s’accumuler. Après IV-FPOP, Supprimer les vers de granulés par centrifugation à 805 x g pendant 2 min. Supprimer la solution d’étanchéité, ajouter 250 l de tampon de lyse (8 M urea, 0,5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaClcl, 1 mM EDTA, 1 mM phenylthylysulfon fluor [PMSF]). Transférer l’échantillon dans un tube de microcentrifuge propre, geler les flashs et les conserver à -80 oC jusqu’à ce que l’échantillon soit digérer. 5. Extraction, purification et protéolyse des protéines Décongeler les échantillons congelés sur la glace et homogénéiser par sonication pendant 10 s, suivi d’une incubation de glace de 60 s. Plusieurs tours de sonication peuvent être nécessaires, l’homogénéat peut être observé sous un stéréomicroscope en plaçant un aliquot d’échantillon de 2 L sur une diapositive de microscope. L’homogénéisation des échantillons est complète lorsqu’on ne voit pas de petits ou pas de vers. Centrifuge a homogénéisé les vers à 400 x g pendant 5 min à 4 oC et recueillir le supernatant dans un tube de microcentrifuge propre. Déterminer les concentrations de protéines de l’échantillon à l’aide d’un essai d’acide bicinchoninique (essai BCA) à l’aide des instructions du fabricant.REMARQUE : La concentration de l’échantillon peut être déterminée à l’aide de n’importe quel essai de concentration de protéine biochimique de choix. Gardez à l’esprit la compatibilité de réactif avec le tampon de lyse (8 M urea, 0.5% SDS, 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF). En outre, une dilution tampon peut être nécessaire. Obtenez 100 g de protéines de chaque échantillon et placez-les dans des tubes de microcentrifugeuses propres. Ajouter le dithiothreitol (TNT) à une concentration finale de 10 mM pour réduire les liaisons de disulfide dans tous les échantillons. Vortex, tourner vers le bas, et incuber des échantillons à 50 oC pendant 45 min. Refroidir les échantillons à température ambiante pendant 10 min. Ajouter l’iodoacetamide (IAA) à une concentration finale de 50 mM pour alkyler les résidus réduits. Vortex, tourner vers le bas, et incuber des échantillons pendant 20 min à température ambiante protégée de la lumière. Immédiatement après l’alkylation, précipiter l’échantillon de protéines en ajoutant 4 volumes d’acétone préconsemment réfrigérée à 100 % et incuber à -20 oC pendant la nuit. Le lendemain, la protéine granulée se précipite par centrifugation à 16 000 x g pendant 10 min. Laver la pastille avec 90 % d’acétone, retirer le supernatant et laisser sécher les granulés pendant 2 à 3 min. Suspendre à nouveau le granule de protéines dans 25 mM Tris-HCl (1 g/L). Ajouter la trypsine à un rapport protéase/protéine final de 1:50 (w/w) et digérer les échantillons à 37 oC pendant la nuit. Le lendemain, étancher la réaction de digestion de la trypsine en ajoutant 5% d’acide formic.REMARQUE : Un minimum de 0,5 g de peptides par échantillon est nécessaire pour l’analyse LC-MS/MS (étapes 6.1-6.5). Déterminer les concentrations de peptides échantillon à l’aide d’un essai quantitatif de peptide colorimétrique (voir le tableau des matériaux) tel que décrit par le protocole du fabricant. 6. Spectrométrie de masse liquide haute performance-tandem (LC-MS/MS) Utilisez les phases mobiles LC suivantes : l’eau en FA (A) à 0,1 % et ACN dans 0,1 % FA (B). Chargez 0,5 g de peptides sur une colonne de piège (180 m à 20 mm) contenant du C18 (5 m, 100 ‘) et l’échantillon de lavage avec 99% de solvant A et 1% B pour 15 minutes à 15 ‘L/débit min. Peptides séparés à l’aide d’une colonne emballée à l’interne (0,075 mm i.d. – 20 mm) avec du matériau de phase inverse C18 (5 m, 125 euros). Utilisez la méthode de séparation analytique suivante : le gradient a été pompé à 300 nL/min pendant 120 min : 0 à 1 min, 3 % B ; 2 à 90 min, 10 à 45 % B; 100 à 105 min, 100% B; 106 à 120 min, 3 % B. Effectuez l’acquisition de peptides en mode ion iony-électrospray (nESI) à l’aide d’un spectromètre de masse haute résolution.REMARQUE : Pour ce protocole, un couple d’instruments LC (UPLC) ultra-performant à un spectromètre de masse haute résolution a été utilisé. L’acquisition dépendante des données a été utilisée. La plage de balayage m/z pour MS1 était de 3750 à 1500 à 60 000 résolutions et 60 s d’exclusion dynamique. Les ions avec les états de charge de 1 et ‘gt;6 ont été exclus. Un objectif de contrôle automatique du gain (AGC) de 5,5e5 a été utilisé avec un temps d’injection maximum de 50 ms et un seuil d’intensité de 5,5e4. Les ions sélectionnés pour le MS2 ont été soumis à la fragmentation de dissociation collisionnelle à haute énergie (HCD) utilisant 32 % d’énergie de collision normalisée. Des ions fragmentés ont été détectés dans le spectromètre avec 15 000 résolutions et une cible AGC de 5,0e4. 7. Analyse des données Rechercher des fichiers MS tandem avec un logiciel d’analyse protéomique ascendant contre la base de données C. elegans. Définissez les paramètres de recherche d’analyse des protéines comme suit : un clivage manqué par trypsine, une plage de masse de peptide de 375 à 1500 m/z, une tolérance de masse fragmentée de 0,02 et une tolérance de masse précurseur de 10 ppm. Carbamidomethylation est définie comme une modification statique et tous connaissent hydroxyl radical modifications de la chaîne latérale9,10 comme dynamique. L’identification peptide est établie à 95% de confiance (moyenne) et résidus à 99% de confiance (élevée). Le taux de fausse découverte (FDR) est fixé à 1%. Exporter des données vers une base de données électronique et résumer l’étendue de l’oxydation par peptide ou résidu à l’aide de l’équation inférieureà 11:REMARQUE : Lorsque la zone EIC modifiée est la zone chromatographique extraite (EIC) du peptide ou des résidus avec une modification oxydative, et la zone EIC est la zone totale du même peptide ou des résidus avec et sans la modification oxydative.