Neisseria gonorrhoeae'nin Metal-Sınırlı Büyümesi, Ev Sahibi Ligandlardan Metal Duyarlı Genlerin Karakterizasyonu ve Metal Edinimi için
Summary
Burada metal alımı için genlerin ekspresyonunu kolaylaştırmak için metal sınırlı sıvı ortamda Neisseria gonorrhoeae büyüme için bir yöntem açıklar. Ayrıca bu koşullarda yetiştirilen gonokokların fenotipini karakterize etmek için aşağı akım deneylerini ana hatlar. Bu yöntemler, diğer bakterilerde metal duyarlı genlerin karakterizasyonu için uygun olarak uyarlanabilir.
Abstract
Demir ve çinko gibi eser metaller gen regülasyonu, kataliz ve protein yapısı gibi prokaryotik süreçlerde önemli rol oynadığı bilinen hayati besinlerdir. Ev sahipleri tarafından metal ayrıştırma genellikle bakteri için metal sınırlamasına yol açar. Bu sınırlama, protein ürünleri bakterilerin metal sınırlı çevrelerinin üstesinden gelmesine izin veren bakteriyel gen ekspresyonuna neden olur. Bu tür genlerin karakterizasyonu zordur. Bakteriler, yukarıda bahsedilen genlerin ekspresyonunu gerçekleştirmeye yardımcı olan bir metal profilini korurken bakteri büyümesine izin vermek için besin metallerine yeterli erişim sağlayan titizlikle hazırlanmış medyada yetiştirilmelidir. Bu nedenle, bu metallerin konsantrasyonları için hassas bir denge kurulmalıdır. Neisseria gonorrhoeaegibi besin açısından titiz bir organizmanın büyümesi, sadece insan konakta hayatta kalmak için evrimleşmiştir, karmaşıklık ek bir düzeyde ekler. Burada, gonokok büyümesi ve istenilen gen ekspresyonuna izin verecek kadar tanımlanmış metal sınırlı bir ortamın hazırlanmasını açıklıyoruz. Bu yöntem araştırmacının demir ve çinkoyu istenmeyen kaynaklardan elde etmesini sağlarken, ortamı da tanımlı demir veya çinko kaynaklarıyla tamamlar. Son olarak, metal leregüle gonokok genlerinin protein ürünlerini karakterize etmeye yardımcı olmak için bu ortamı kullanan üç deneyi ana hatlatıyoruz.
Introduction
Neisseria belsoğukluğu yaygın cinsel yolla bulaşan enfeksiyon bel soğukluğu neden olur. Enfeksiyon sırasında, patojenik Neisseria bakterilerin insankonak1 ,2,3tarafından metal kısıtlama çabaları aşmak için izin metal duyarlı genlerin bir repertoire ifade . Demir ve çinko gibi eser metaller katalitik bölgelerdeenzimlere bağlanma, redoks reaksiyonlarına katılım gibi birçok hücresel süreçte kilit rol oynarlar ve çeşitli proteinlerde yapısal faktörler olarak4,5. Metal sınırlı koşullarda, metal duyarlı loci derepressed ve ortaya çıkan proteinler bu besinlerin edinimi yardımcı olabilir. Bu genlerin ve proteinlerin karakterizasyonu araştırmacı için benzersiz bir teknik sorun sunar. Metal iyonları kendi yerli loci bu genlerin transkripsiyon ikna etmek için bakterilerden uzak tutulmalıdır, ancak metal yüklü medya bu iyonların etkili şelasyon optimize etmek zor olabilir. Kaynak suyun farklı metal profilleri ve toz malzemelerin doğal lot-to-lot varyasyon6 zengin bir ortamdan belirli bir metal kaldırmak için gerekli şelatör miktarı farklı yerler arasında değişecektir anlamına gelir, madde satıcıları, ve kimyasal envanter değiştirilir gibi zaman içinde bile.
Bu zorluğu aşmak için, çözeltiden eser metalleri çıkarmak için hazırlık sırasında Chelex-100 reçin ile tedavi edilen tanımlanmış bir ortamın hazırlanmasını anlatıyoruz. Bu ortam yeterince besin yoğun insan konak dışında kültür zordur gonokok, büyümesini sağlamak için yoğun ve araştırmacı kendi tanımlanmış kaynakları ve konsantrasyonları ekleyerek belirli bir metal profili tanıtmak için izin verir Metal. İstenilen metallerin tükenmiş ortama kontrollü şekilde eklenmesi yöntemi deneysel tutarlılığı artırır ve su kaynağı ve kimyasal lot sayıları gibi faktörlere bakılmaksızın sağlam, çoğaltılabilir deneylere olanak sağlar. Ayrıca, bu ortam sadece küçük değişiklikler ile bir sıvı veya katı olarak dağıtılabilir, oldukça çok yönlü hale.
Bu ortamın yararını göstermek için, gonokok alabilmesi için bir protokol uyguluyoruz ve metalduyarlı Neisseria genlerini karakterize etmek için üç başarılı deney imal ediyoruz. İlk olarak, metal tükenmiş veya takviye edilmiş kültürlerden gonokok tüm hücreli lysates hazırlamak ve metal duyarlı loci protein üretiminin değişken düzeyde göstermek. Daha sonra gonokok alonu belirli, uygulanabilir çinko kaynaklarının takviyesi ile kontrol edilir çinko sınırlı büyüme töz anahat. Son olarak, metal içeren ligandlara bağlanan metal duyarlı yüzey reseptörlerini ifade eden tüm gonokok hücrelerini gösteren bağlayıcı tahliller gösteririz. Bu reseptörlerin başarılı yüzey sunumu metal tükenmiş ortamda büyüme gerektirir.
Mevcut protokol özellikle Neisseria gonorrhoeaeiçin optimize edilmiştir, ancak çok sayıda diğer bakteriyel patojenler enfeksiyon sırasında metal edinme stratejileri istihdam7, Bu protokol diğer bakterilerde metal homeostaz çalışması için adapte edilebilir bu yüzden. Diğer bakteriler gonokok biraz daha farklı metal gereksinimleri olabilir gibi bu ortam ve diğer bakterilerde kullanılmak üzere bu deneysel protokolleri optimize büyük olasılıkla metal şelatör konsantrasyonları ve / veya Chelex-100 ile tedavi süresi hafif değişiklik gerektirir. Demir ve çinko açıklanan araştırmalar için endişe birincil metaller, ancak diğer metaller (örneğin, manganez) bakteriler için kritik olarak gösterilmiştir, Neisseriadahil 8,9,10,11,12. Ayrıca ökaryotik hücre kültürü çalışmalarında metal karakterizasyonlar için de benzer yöntemler tanımlanmıştır. 13.000
Protocol
Representative Results
Discussion
Büyüme ortamı mikrobiyolojik araştırmalarda çeşitli rollere hizmet vermektedir. Özel ortam seçimi, zenginleştirme ve çalışma birçok benzersiz türleri için çeşitli diğer uygulamalar için kullanılır. Böyle bir uygulama metal duyarlı genlerin indüksiyon, genellikle belirli bir metal iyon hedefleyen belirli bir şelatör eklenmesi ile gerçekleştirilir. Bu yöntem sınırlıdır, çeşitli eser metaller için gerekli şelasyon miktarı benzersiz metal profilleri içeren farklı su kaynakları nedeni…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH’nin R01 AI125421, R01 AI127793 ve U19 AI144182 hibeleri ile desteklenmiştir. Yazar, bu yöntemin okunmasında ve incelenmesinde emeği geçen tüm laboratuvar üyelerine teşekkür eder.
Materials
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
References
- Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
- Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
- Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
- Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
- Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
- Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
- Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
- Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
- Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
- Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
- Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
- Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
- Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733 (2013).
- Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937 (2019).
- Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
- Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
- Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
- Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
- Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
- Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
- Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
- Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
- Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
- Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
- Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
- Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
- Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
- Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
- Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
- Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
- Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
- Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).
