Crecimiento limitado por metales de Neisseria gonorrhoeae para la caracterización de genes sensibles a los metales y la adquisición de metales de Host Ligands
Summary
Aquí describimos un método para el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae en medio líquido restringido por metal para facilitar la expresión de genes para la toma de metales. También delineamos experimentos aguas abajo para caracterizar el fenotipo de gonococci cultivados en estas condiciones. Estos métodos pueden adaptarse para ser adecuados para la caracterización de genes sensibles al metal en otras bacterias.
Abstract
Los metales traza como el hierro y el zinc son nutrientes vitales que se sabe que desempeñan un papel clave en los procesos procasinoticos, como la regulación genética, la catálisis y la estructura proteica. El secuestro de metales por parte de los huéspedes a menudo conduce a la limitación del metal para la bacteria. Esta limitación induce la expresión génica bacteriana cuyos productos proteicos permiten a las bacterias superar su entorno limitado por metales. La caracterización de estos genes es un reto. Las bacterias deben cultivarse en medios meticulosamente preparados que permitan un acceso suficiente a los metales nutricionales para permitir el crecimiento bacteriano manteniendo al mismo tiempo un perfil metálico propicio para lograr la expresión de los genes antes mencionados. Como tal, debe establecerse un equilibrio delicado para las concentraciones de estos metales. El cultivo de un organismo nutricionalmente fastidioso como Neisseria gonorrhoeae,que ha evolucionado para sobrevivir sólo en el huésped humano, añade un nivel adicional de complejidad. Aquí, describimos la preparación de un medio definido limitado por metales suficiente para permitir el crecimiento gonocócico y la expresión génica deseada. Este método permite al investigador quelar hierro y zinc de fuentes no deseadas mientras complementa los medios con fuentes definidas de hierro o zinc, cuya preparación también se describe. Por último, esbozamos tres experimentos que utilizan este medio para ayudar a caracterizar los productos proteicos de los genes gonocócicos regulados por metales.
Introduction
Neisseria gonorrhoeae causa la gonorrea de infección de transmisión sexual común. Durante la infección, la patógena Neisseria expresa un repertorio de genes sensibles al metal que permiten a las bacterias superar los esfuerzos de restricción de metales del huésped humano1,2,3. Los metales traza como el hierro y el zinc desempeñan un papel clave en muchos procesos celulares, como la unión a enzimas en sitios catalíticos, la participación en reacciones redox, y como factores estructurales en varias proteínas4,5. En condiciones limitadas por metales, los loci sensibles al metal están deprimidos y sus proteínas resultantes pueden ayudar a la adquisición de estos nutrientes. La caracterización de estos genes y proteínas presenta un desafío técnico único para el investigador. Los iones metálicos deben ser retenidos de las bacterias con el fin de inducir la transcripción de estos genes de sus loci nativos, pero la quelación efectiva de estos iones de medios cargados de metal puede ser difícil de optimizar. Los diferentes perfiles metálicos del agua de origen y la variación inherente de lote a lote6 de ingredientes en polvo significa que la cantidad de quelante necesaria para eliminar un metal específico de un medio rico variará entre diferentes ubicaciones, proveedores de ingredientes, e incluso con el tiempo dentro de un solo laboratorio como inventario químico se reemplaza.
Para evitar este desafío, describimos la preparación de un medio definido que se trata con resina Chelex-100 durante la preparación para eliminar los metales traza de la solución. Este medio es lo suficientemente denso como para permitir el crecimiento del gonococo, que es difícil de cultivar fuera del huésped humano, y permite al investigador introducir un perfil de metal específico mediante la adición de sus propias fuentes definidas y concentraciones de Metales. El método de adición controlada de metales deseados al medio agotado aumenta la consistencia experimental y permite experimentos robustos y replicables independientemente de factores como la fuente de agua y el número de lote químico. Además, este medio se puede desplegar como líquido o sólido con sólo pequeñas modificaciones, por lo que es bastante versátil.
Con el fin de demostrar la utilidad de este medio, delineamos un protocolo para su uso para el crecimiento gonococo y describimos tres experimentos exitosos para caracterizar los genes Neisseria sensibles a los metales. En primer lugar, preparamos lisiados de células enteras gonocócicas a partir de cultivos agotados por metales o suplementados y demostramos niveles variables de producción de proteínas a partir de loci sensibles al metal. A continuación, delineamos un ensayo de crecimiento restringido por zinc en el que el crecimiento gonocócico se controla mediante la suplementación de fuentes específicas de zinc útiles. Por último, mostramos ensayos de unión que demuestran células gonocócicas enteras que expresan la unión de receptores de superficie sensibles al metal a sus respectivos ligandos que contienen metal. La presentación superficial exitosa de estos receptores requiere un crecimiento en un medio agotado por metales.
El presente protocolo fue optimizado específicamente para Neisseria gonorrhoeae,pero muchos otros patógenos bacterianos emplean estrategias de adquisición de metales durante la infección7,por lo que este protocolo puede ser adaptado para el estudio de la homeostasis metálica en otras bacterias. Optimizar este medio y estos protocolos experimentales para su uso en otras bacterias probablemente requerirá una ligera modificación de las concentraciones de quelador de metal y / o tiempo de tratamiento con Chelex-100, ya que otras bacterias pueden tener requisitos de metal ligeramente diferentes que el gonococo. El hierro y el zinc son los principales metales de preocupación para las investigaciones descritas, pero otros metales (por ejemplo, manganeso) se han demostrado como críticos para las bacterias, incluyendo Neisseria8,9,10,11,12. Además, se han descrito métodos similares para caracterizaciones metálicas en el trabajo de cultivo celular eucariota, que también pueden ser considerados. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
Los medios de crecimiento sirven una variedad de funciones en la investigación microbiológica. Los medios especializados se utilizan para la selección, el enriquecimiento y varias otras aplicaciones para muchos tipos únicos de estudio. Una de estas aplicaciones es la inducción de genes sensibles al metal, que normalmente se logra mediante la adición de un quelante específico que apunta a un ion metálico en particular. Este método es limitado, ya que la cantidad de quelación necesaria para varios metales traza e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH R01 AI125421, R01 AI127793 y U19 AI144182. El autor de la escritura desea dar las gracias a todos los miembros del laboratorio que contribuyeron a la corrección y revisión de este método.
Materials
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
References
- Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
- Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
- Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
- Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
- Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
- Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
- Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
- Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
- Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
- Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
- Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
- Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
- Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733 (2013).
- Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937 (2019).
- Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
- Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
- Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
- Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
- Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
- Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
- Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
- Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
- Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
- Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
- Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
- Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
- Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
- Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
- Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
- Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
- Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
- Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).
