Crescimento metal-limitado de neisseria gonorrhoeae para caracterização de genes reativos metálicos e aquisição de metais da Host Ligands
Summary
Descrevemos aqui um método de crescimento da gonorreia Neisseria em meio líquido restrito ao metal para facilitar a expressão de genes para a captação de metais. Também delineamos experimentos a jusante para caracterizar o fenótipo de gonococci cultivado nessas condições. Esses métodos podem ser adaptados para serem adequados para caracterização de genes reativos metálicos em outras bactérias.
Abstract
Metais de rastreamento como ferro e zinco são nutrientes vitais conhecidos por desempenhar papéis-chave em processos procarióticos, incluindo regulação genética, catalise e estrutura proteica. O sequestro metálico por anfitriões muitas vezes leva à limitação metálica para a bactéria. Essa limitação induz a expressão genética bacteriana cujos produtos proteicos permitem que as bactérias superem seu ambiente limitado ao metal. Caracterização desses genes é desafiadora. As bactérias devem ser cultivadas em mídia meticulosamente preparada que permite acesso suficiente a metais nutricionais para permitir o crescimento bacteriano, mantendo um perfil metálico propício para alcançar a expressão dos genes acima mencionados. Como tal, deve-se estabelecer um equilíbrio delicado para as concentrações desses metais. Cultivar um organismo nutricionalmente exigente, como a norréia neisseria,que evoluiu para sobreviver apenas no hospedeiro humano, adiciona um nível adicional de complexidade. Aqui, descrevemos a preparação de um meio metálico limitado definido suficiente para permitir o crescimento gonocócica e a expressão genética desejada. Este método permite que o pesquisador chelate ferro e zinco de fontes indesejadas enquanto complementa a mídia com fontes definidas de ferro ou zinco, cuja preparação também é descrita. Finalmente, descrevemos três experimentos que utilizam essa mídia para ajudar a caracterizar os produtos proteicos de genes gonocócicos regulados pelo metal.
Introduction
A gonorreia de neisseria causa a gonorreia de infecção sexualmente transmissível comum. Durante a infecção, neisseria patogênica expressa um repertório de genes reativos metálicos que permitem que as bactérias superem os esforços de restrição metálica pelo hospedeiro humano1,2,3. Os metais de rastreamento como ferro e zinco desempenham papéis-chave em muitos processos celulares, como a vinculação a enzimas em sítios catalíticos, participação em reações redoxas e como fatores estruturais em várias proteínas4,5. Em condições limitadas a metais, loci reativo metálico são desreprimidos e suas proteínas resultantes podem ajudar na aquisição desses nutrientes. A caracterização desses genes e proteínas apresenta um desafio técnico único para o pesquisador. Íons metálicos devem ser retidos de bactérias para induzir a transcrição desses genes de seus loci nativos, mas uma queda eficaz desses íons da mídia carregada de metal pode ser difícil de otimizar. Os diferentes perfis metálicos de água de origem e variação inerente lote a lote6 de ingredientes em pó significa que a quantidade de chelator necessária para remover um metal específico de um meio rico vai variar entre diferentes locais, fornecedores de ingredientes, e mesmo ao longo do tempo dentro de um único laboratório à medida que o inventário químico é substituído.
Para contornar este desafio, descrevemos a preparação de um meio definido que é tratado com resina Chelex-100 durante a preparação para remover metais de rastreamento da solução. Este meio é suficientemente nutriente denso para permitir o crescimento do gonococcus, que é difícil de cultivar fora do hospedeiro humano, e permite que o pesquisador introduza um perfil metálico específico, adição de suas próprias fontes e concentrações definidas de Metais. O método de complemento controlado de metais desejados para médio esgotado aumenta a consistência experimental e permite experimentos robustos e replicáveis, independentemente de fatores como fonte de água e números de lotes químicos. Além disso, essa mídia pode ser implantada como líquida ou sólida com apenas pequenas modificações, tornando-a bastante versátil.
Para demonstrar a utilidade desse meio, delineamos um protocolo para seu uso para o crescimento gonocócica e descrevemos três experimentos bem sucedidos para caracterizar genes Neisseria responsivos ao metal. Primeiro, preparamos lisatos de células inteiras gonocócicas de culturas metal-esgotadas ou suplementadas e demonstramos níveis variáveis de produção de proteínas a partir de loci reativo metálico. Em seguida, delineamos um ensaio de crescimento restrito ao zinco no qual o crescimento gonocócica é controlado pela suplementação de fontes específicas e utilizáveis de zinco. Finalmente, mostramos ensaios vinculativos que demonstram células gonocócicas inteiras expressando receptores de superfície religados ao metal ligados aos seus respectivos ligantes contendo metal. A apresentação superficial bem-sucedida desses receptores requer crescimento em meio metálico.
O protocolo atual foi otimizado especificamente para a neisseria gonorrhoeae,mas inúmeros outros patógenos bacterianos empregam estratégias de aquisição de metais durante a infecção7, de modo que esse protocolo pode ser adaptado para o estudo da homeostase metálica em outras bactérias. Otimizar esta mídia e esses protocolos experimentais para uso em outras bactérias provavelmente exigirá uma leve modificação das concentrações de quedor de metal e/ou tempo de tratamento com chelex-100, já que outras bactérias podem ter requisitos metálicos ligeiramente diferentes do gonococcus. Ferro e zinco são os metais primários de preocupação para as investigações descritas, mas outros metais (por exemplo, manganês) têm sido demonstrados como críticos para bactérias, incluindo Neisseria8,9,10,11,12. Além disso, métodos semelhantes foram descritos para caracterizações metálicas no trabalho de cultura celular eucatótica, que também pode ser considerado. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
A mídia de crescimento serve a uma variedade de papéis na pesquisa microbiológica. A mídia especializada é usada para seleção, enriquecimento e várias outras aplicações para muitos tipos únicos de estudo. Uma dessas aplicações é a indução de genes reativos metálicos, que normalmente é realizado pela adição de um chellador específico que tem como alvo um determinado íon metálico. Este método é limitado, pois a quantidade de queda necessária para vários metais de rastreamento provavelmente será …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do NIH R0125421, R01 AI127793 e U19 AI144182. O autor da redação gostaria de agradecer a todos os membros do laboratório que contribuíram para a revisão e revisão deste método.
Materials
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
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