ホストリガンドからの金属応答遺伝子の特性評価と金属獲得のためのナイセリア淋菌の金属有限成長

ナイセリア淋菌は、一般的な性感染症淋病を引き起こす。感染時、病原性ナイセリアは、細菌がヒト宿主^1、2、3による金属制限の努力を克服することを可能にする金属応答性遺伝子のレパートリーを発現する。鉄や亜鉛などの微量金属は、触媒部位の酵素への結合、酸化還元反応への参加、および様々なタンパク質の構造因子として^4、5などの多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。金属に限られた条件では、金属応答性の遺伝子座は破壊され、その結果生じるタンパク質はこれらの栄養素の獲得を助けることができる。これらの遺伝子およびタンパク質の特性評価は、研究者にとってユニークな技術的課題を提示する。金属イオンは、これらの遺伝子のネイティブ遺伝子の転写を天然の遺伝子から誘導するためには細菌から源泉徴収されなければならないが、金属を含む培地からのこれらのイオンの有効なキラキラを最適化することは困難である。原料水の異なる金属プロファイルと粉末成分の固有のロット間変動⁶は、豊富な媒体から特定の金属を除去するために必要なキレート剤の量が異なる場所、成分ベンダー、さらには化学在庫として単一の実験室内で時間をかけて変化することを意味します。

この課題を回避するために、溶液から微量金属を除去するための調製中にChelex-100樹脂で処理される定義された培地の調製について説明する。この培地は、ヒト宿主の外で培養することが困難であるゴノコッカスの増殖を可能にする十分な栄養密度であり、また、研究者は独自の定義された供給源および濃度を加えることによって特定の金属プロファイルを導入することを可能にする。金属。必要な金属を枯渇させる金属の制御されたアドインの方法は、実験の一貫性を高め、水源や化学ロット数などの要因に関係なく、堅牢で複製可能な実験を可能にします。さらに、この媒体はわずかな変更だけ液体か固体として展開することができる、非常に多目的な。

この培地の有用性を実証するために、ゴノコッカル成長のためのプロトコルを概説し、金属応答性Neisseria遺伝子を特徴付けるための3つの成功した実験について説明する。まず、金属枯渇または補足培養物からゴノコッカス全細胞ライセートを調製し、金属応答性遺伝子座からのタンパク質産生の可変レベルを実証する。次に、特定の有効な亜鉛源の補給によってゴノコッカルの成長を制御する亜鉛制限成長アッセイの概要を説明します。最後に、金属を含むリガンドに結合する金属応答性表面受容体を発現する全ゴノコッカル細胞を示す結合アッセイを示す。これらの受容体の表面提示に成功するには、金属枯渇培地の成長が必要です。

本プロトコルは、ナイセリア淋菌のために特別に最適化されたが、他の多くの細菌病原体は、感染中に金属獲得戦略を採用して^7、このプロトコルは、他の細菌における金属恒常性の研究のために適応され得る。他の細菌で使用するためにこの培地およびこれらの実験プロトコルを最適化するには、他の細菌がゴノコッカスとわずかに異なる金属要件を有する可能性があるため、キレックス-100による金属キレート濃度および/または処理時間のわずかな変更が必要になる可能性があります。鉄と亜鉛は、記載された調査のために懸念される主要な金属であるが、他の金属(例えば、マンガン)は、ナイセリア^{8、9、10、11、12}を含む細菌に対して重要として実証されている。さらに、真核細胞培養作業における金属特性評価についても同様の方法が記載されているが、これも考えられる。¹³