Metal-Limited Crescita di Neisseria gonorrhoeae per la caratterizzazione dei geni metal-reattivi e l'acquisizione di metalli da Host Ligands
Summary
Descriviamo qui un metodo per la crescita delle gonorree Neisseria nel mezzo liquido con restrizioni metalliche per facilitare l’espressione dei geni per l’assorbimento dei metalli. Illustremo anche esperimenti a valle per caratterizzare il fenotipo dei gonocchi coltivati in queste condizioni. Questi metodi possono essere adattati per essere adatti per la caratterizzazione di geni che rispondono ai metalli in altri batteri.
Abstract
I metalli traccia come ferro e zinco sono nutrienti vitali noti per svolgere un ruolo chiave nei processi procatotici, tra cui la regolazione genica, la catalisi e la struttura delle proteine. Il sequestro di metallo da parte degli ospiti spesso porta a limitazioni di metallo per il batterio. Questa limitazione induce l’espressione genica batterica i cui prodotti proteici consentono ai batteri di superare il loro ambiente limitato dai metalli. La caratterizzazione di tali geni è impegnativa. I batteri devono essere coltivati in supporti meticolosamente preparati che consentano un accesso sufficiente ai metalli nutrizionali per consentire la crescita batterica, pur mantenendo un profilo metallico favorevole al raggiungimento dell’espressione dei suddetti geni. Come tale, un delicato equilibrio deve essere stabilito per le concentrazioni di questi metalli. Coltivare un organismo nutrizionalmente esigente come Neisseria gonorrhoeae, che si è evoluto per sopravvivere solo nell’ospite umano, aggiunge un ulteriore livello di complessità. Qui, descriviamo la preparazione di un mezzo definito a limitata di metalli sufficiente a consentire la crescita gonococcica e l’espressione genica desiderata. Questo metodo consente allo sperimentatore di maticare ferro e zinco da fonti indesiderate integrando i media con fonti definite di ferro o zinco, la cui preparazione è anche descritta. Infine, illustreremo tre esperimenti che utilizzano questo mezzo per aiutare a caratterizzare i prodotti proteici dei geni gonococcici regolati dai metalli.
Introduction
Neisseria gonorrhoeae provoca la comune infezione trasmessa sessualmente gonorrea. Durante l’infezione, patogeni Neisseria esprimono un repertorio di geni che rispondono ai metalli che permettono ai batteri di superare gli sforzi di restrizione dei metalli da parte dell’ospite umano1,2,3. I metalli traccia come il ferro e lo zinco svolgono un ruolo chiave in molti processi cellulari, come il legame agli enzimi nei siti catalitici, la partecipazione alle reazioni di redox e come fattori strutturali in varie proteine4,5. In condizioni di metallo limitato, i loci che rispondono ai metalli sono derepressi e le loro proteine risultanti possono aiutare ad acquisire questi nutrienti. La caratterizzazione di questi geni e proteine rappresenta una sfida tecnica unica per lo sperimentatore. Gli ioni metallici devono essere trattenuti dai batteri per indurre la trascrizione di questi geni dai loro loci nativi, ma una malattia efficace di questi ioni da supporti carichi di metalli può essere difficile da ottimizzare. I diversi profili metallici dell’acqua di origine e la variazione intrinseca di6 ingredienti in polvere significano che la quantità di chelatore necessaria per rimuovere un metallo specifico da un mezzo ricco varierà tra diverse posizioni, fornitori di ingredienti, e anche nel tempo all’interno di un singolo laboratorio come inventario chimico viene sostituito.
Per aggirare questa sfida, descriviamo la preparazione di un mezzo definito che viene trattato con resina Chelex-100 durante la preparazione per rimuovere i metalli traccia dalla soluzione. Questo mezzo è sufficientemente nutriente denso per consentire la crescita del gonococco, che è difficile da coltura al di fuori dell’ospite umano, e permette allo sperimentatore di introdurre un profilo metallico specifico aggiungendo le proprie fonti definite e concentrazioni di Metalli. Il metodo di controllo add-back dei metalli desiderati a medio impoverito aumenta la consistenza sperimentale e consente esperimenti robusti e replicabili indipendentemente da fattori quali la fonte d’acqua e il numero di lotti chimici. Inoltre, questo supporto può essere distribuito come liquido o solido con solo piccole modifiche, rendendolo abbastanza versatile.
Al fine di dimostrare l’utilità di questo mezzo, descriviamo un protocollo per il suo utilizzo per la crescita gonococcica e descriviamo tre esperimenti di successo per caratterizzare i geni Neisseria sensibili ai metalli. In primo luogo, prepariamo lismi a cellule intere gonococcali da colture impoverite o integrate di metallo e dimostriamo livelli variabili di produzione di proteine da loci che rispondono ai metalli. Viene quindi illustrato un saggio di crescita limitato allo zinco in cui la crescita gonococcale è controllata dal completamento di specifiche fonti di zinco utilizzabili. Infine, mostriamo saggi vincolanti che dimostrano cellule gonococciche intere che esprimono recettori di superficie che rispondono al metallo che si legano ai rispettivi ligoandi contenenti metalli. La presentazione superficiale di successo di questi recettori richiede la crescita nel mezzo impoverito di metalli.
L’attuale protocollo è stato ottimizzato specificamente per neisseria gonorrhoeae, ma numerosi altri patogeni batterici impiegano strategie di acquisizione di metalli durante l’infezione7, quindi questo protocollo può essere adattato per lo studio dell’omeostasi metallica in altri batteri. Ottimizzare questo supporto e questi protocolli sperimentali per l’uso in altri batteri richiederà probabilmente una leggera modifica delle concentrazioni di chelatori metallici e/o il tempo di trattamento con Chelex-100, poiché altri batteri possono avere requisiti metallici leggermente diversi rispetto al gonococcus. Ferro e zinco sono i metalli primari di preoccupazione per le indagini descritte, ma altri metalli (ad esempio, manganese) sono stati dimostrati come critici per i batteri, tra cui Neisseria8,9,10,11,12. Inoltre, sono stati descritti metodi simili per le caratterizzazioni dei metalli nel lavoro di coltura cellulare eucarome, che può anche essere considerato. 13 del sistema
Protocol
Representative Results
Discussion
I mezzi di crescita riscantono una varietà di ruoli nella ricerca microbiologica. I supporti specializzati vengono utilizzati per la selezione, l’arricchimento e varie altre applicazioni per molti tipi di studio unici. Una di queste applicazioni è l’induzione di geni che rispondono ai metalli, che viene in genere realizzata mediante l’aggiunta di un chelante specifico che si rivolge a un particolare ione metallico. Questo metodo è limitato, in quanto la quantità di chelazione necessaria per vari metalli traccia è pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01 AI125421, R01 AI127793 e U19 AI144182. L’autore dello scrittore desidera ringraziare tutti i membri del laboratorio che hanno contribuito alla revisione e alla revisione di questo metodo.
Materials
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
References
- Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
- Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
- Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
- Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
- Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
- Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
- Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
- Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
- Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
- Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
- Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
- Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
- Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733 (2013).
- Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937 (2019).
- Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
- Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
- Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
- Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
- Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
- Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
- Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
- Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
- Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
- Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
- Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
- Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
- Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
- Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
- Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
- Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
- Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
- Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).
