Metal-Limited Groei van Neisseria gonorrhoeae voor karakterisering van metal-responsive genen en metaalacquisitie van Host Ligands
Summary
We beschrijven hier een methode voor de groei van Neisseria gonorroe in metaal-beperkte vloeibare medium om de expressie van genen voor metaalopname te vergemakkelijken. We schetsen ook downstream experimenten om het fenotype van gonokokken te karakteriseren die in deze omstandigheden worden geteeld. Deze methoden kunnen worden aangepast om geschikt te zijn voor karakterisering van metaal-responsieve genen in andere bacteriën.
Abstract
Sporenmetalen zoals ijzer en zink zijn essentiële voedingsstoffen waarvan bekend is dat ze een belangrijke rol spelen in prokaryotische processen, waaronder genregulatie, katalyse en eiwitstructuur. Metaalvastlegging door gastheren leidt vaak tot metaalbeperking voor de bacterie. Deze beperking veroorzaakt bacteriële genexpressie waarvan de eiwitproducten bacteriën in staat stellen om hun metaalbeperkte omgeving te overwinnen. Karakterisering van dergelijke genen is een uitdaging. Bacteriën moeten worden gekweekt in zorgvuldig voorbereide media die voldoende toegang tot voedingsmetalen mogelijk maakt om bacteriële groei mogelijk te maken met behoud van een metalen profiel dat bevorderlijk is voor het bereiken van expressie van de bovengenoemde genen. Daarom moet een delicaat evenwicht worden vastgesteld voor de concentraties van deze metalen. Het kweken van een nutritioneel veeleisend organisme zoals Neisseria gonorroe, dat is geëvolueerd om alleen te overleven in de menselijke gastheer, voegt een extra niveau van complexiteit. Hier beschrijven we de voorbereiding van een gedefinieerd metaal-beperkt medium voldoende om gonokokkengroei en de gewenste genexpressie mogelijk te maken. Deze methode stelt de onderzoeker in staat om ijzer en zink uit ongewenste bronnen te chelateen en tegelijkertijd de media aan te vullen met gedefinieerde bronnen van ijzer of zink, waarvan het preparaat ook wordt beschreven. Tot slot schetsen we drie experimenten die deze media gebruiken om de eiwitproducten van metaalgereguleerde gonokokkengenen te karakteriseren.
Introduction
Neisseria gonorroe veroorzaakt de gemeenschappelijke seksueel overdraagbare infectie gonorroe. Tijdens infectie, pathogene Neisseria uitdrukken een repertoire van metaal-responsieve genen die het mogelijk maken de bacteriën metaal beperking inspanningen te overwinnen door de menselijke gastheer1,2,3. Sporenmetalen zoals ijzer en zink spelen een belangrijke rol in veel cellulaire processen, zoals binding aan enzymen in katalytische plaatsen, deelname aan redox-reacties en als structurele factoren in verschillende eiwitten4,5. In metaalbeperkte omstandigheden worden metaalresponsieve loci onderdrukt en kunnen de resulterende eiwitten de aankoop van deze voedingsstoffen helpen. Karakterisering van deze genen en eiwitten vormt een unieke technische uitdaging voor de onderzoeker. Metaalionen moeten worden ingehouden van bacteriën om transcriptie van deze genen te induceren uit hun eigen loci, maar effectieve chelatie van deze ionen uit met metaal beladen media kan moeilijk te optimaliseren zijn. De verschillende metalen profielen van bronwater en inherente lot-to-lot variatie6 van poedervormige ingrediënten betekent dat de hoeveelheid chelator die nodig is om een specifiek metaal te verwijderen uit een rijk medium zal variëren tussen verschillende locaties, ingrediënten leveranciers, en zelfs na verloop van tijd binnen een enkel laboratorium als chemische inventaris wordt vervangen.
Om deze uitdaging te omzeilen, beschrijven we de voorbereiding van een gedefinieerd medium dat tijdens de voorbereiding wordt behandeld met Chelex-100 hars om sporenmetalen uit de oplossing te verwijderen. Dit medium is voldoende voedingsstof dicht om de groei van gonokokken mogelijk te maken, wat moeilijk te kweken is buiten de menselijke gastheer, en stelt de onderzoeker in staat om een specifiek metaalprofiel in te voeren door toevoeging van zijn eigen gedefinieerde bronnen en concentraties van Metalen. De methode van gecontroleerde add-back van gewenste metalen aan uitgeput medium verhoogt experimentele consistentie en zorgt voor robuuste, repliceerbare experimenten, ongeacht factoren zoals waterbron en chemische partij nummers. Bovendien kan deze media worden ingezet als een vloeistof of vaste stof met slechts kleine wijzigingen, waardoor het heel veelzijdig.
Om het nut van dit medium aan te tonen, schetsen we een protocol voor het gebruik ervan voor gonokokkengroei en beschrijven we drie succesvolle experimenten om metaalresponsieve Neisseria-genen te karakteriseren. Ten eerste bereiden we gonokokken hele cel lysaten uit metaal-uitgeput of aangevuld culturen en tonen variabele niveaus van eiwitproductie van metaal-responsieve loci. Vervolgens schetsen we een zink-beperkte groeitest waarbij de groei van gonokokken wordt gecontroleerd door suppletie van specifieke, bruikbare zinkbronnen. Ten slotte tonen we bindende testen die hele gonokokkencellen aantonen die metaalresponsieve oppervlaktereceptoren uitdrukken die bindend zijn voor hun respectieve metaalhoudende liganden. Succesvolle oppervlaktepresentatie van deze receptoren vereist groei in metaal-uitgeput medium.
Het huidige protocol is speciaal geoptimaliseerd voor Neisseria gonorroe, maar tal van andere bacteriële pathogenen maken gebruik van metaal verwerving strategieën tijdens infectie7,dus dit protocol kan worden aangepast voor de studie van metalen homeostase in andere bacteriën. Het optimaliseren van deze media en deze experimentele protocollen voor gebruik in andere bacteriën zal waarschijnlijk een lichte wijziging van de concentraties van metalen chelator en / of de behandeling tijd met Chelex-100, zoals andere bacteriën kunnen iets andere metaal eisen dan gonococcus. IJzer en zink zijn de primaire metalen die zich zorgen maken over de beschreven onderzoeken, maar andere metalen (bijvoorbeeld mangaan) zijn als kritiek voor bacteriën aangetoond, waaronder Neisseria8,9,10,11,12. Bovendien zijn soortgelijke methoden beschreven voor metaalkarakteriseringen in eukaryotische celkweekwerk, dat ook kan worden overwogen. 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Groeimedia vervullen verschillende rollen in microbiologisch onderzoek. Gespecialiseerde media worden gebruikt voor selectie, verrijking, en diverse andere toepassingen voor vele unieke soorten studie. Een dergelijke toepassing is de inductie van metaal-responsieve genen, die meestal wordt bereikt door toevoeging van een specifieke chelator die zich richt op een bepaalde metalen ion. Deze methode is beperkt, omdat de hoeveelheid chelatie die nodig is voor verschillende spoormetalen waarschijnlijk variabel zal zijn als ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01 AI125421, R01 AI127793 en U19 AI144182. De schriftelijke auteur wil alle lableden bedanken die hebben bijgedragen aan het proeflezen en beoordelen van deze methode.
Materials
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
References
- Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
- Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
- Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
- Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
- Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
- Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
- Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
- Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
- Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
- Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
- Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
- Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
- Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733 (2013).
- Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937 (2019).
- Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
- Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
- Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
- Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
- Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
- Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
- Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
- Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
- Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
- Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
- Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
- Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
- Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
- Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
- Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
- Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
- Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
- Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).
