Muestreo y análisis de señales de olor animal

Se sabe muy poco acerca de los cambios químicos que sustentan las señales olfativas en animales¹, también debido a los desafíos metodológicos en el registro y cuantificación de perfiles químicos volátiles de olores². Hay varios escollos potenciales cuando se trabaja con matrices químicas altamente complejas; estos incluyen al tomar muestras y analizar las muestras de olor^3.

En el Rosalind Franklin Science Center de la Universidad de Wolverhampton, estamos llevando a cabo el análisis de olores y marcas de olor para comprender cómo pueden ser utilizados por los animales. Combinamos la semioquímica con la ecología del comportamiento, la endocrinología y la citología para mejorar nuestra comprensión del papel que desempeñan las señales olfativas en la comunicación animal.

Hemos desarrollado una metodología y luego analizado olores y marcas de una variedad de especies, incluidos varios primates no humanos (es decir, lémures coronados, lémures de volantes rojos, macacos japoneses, babuinos olivares, chimpancés) y otros mamíferos (es decir, gatos, vacas). Hemos recogido y analizado una variedad de muestras, incluyendo orina, heces, cabello y secreciones de olor de glándulas olfativas. Estos olores y marcas de olor consisten en mezclas complejas de compuestos y, por lo tanto, cualquier metodología utilizada para su análisis debe incluir alguna forma de técnica de separación. Como se ilustra, también se producen en una serie de matrices que requiere el uso de técnicas para extraer los componentes de interés.

Estudios previos de Vaglio et al.⁴ y otros autores⁵ utilizaron la extracción dinámica del espacio de cabeza (DHS) con cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), mientras que la extracción directa con disolvente⁶ y las extracciones complejas^{con disolventes 7} también se han utilizado. En particular, el muestreo dinámico del espacio de cabeza implica purgar el espacio de cabeza con un volumen conocido de gas inerte que, en última instancia, elimina todos los compuestos volátiles con la excepción de aquellos que muestran una fuerte afinidad por la matriz de la muestra (por ejemplo, compuestos polares en muestras acuosas).

Para la metodología actual, hemos adoptado la técnica de microextracción en fase sólida del espacio de la cabeza (HS-SPME) junto con GC-MS. En particular, hemos desarrollado y mejorado la metodología ya utilizada por Vaglio et al. en su anterior laboratorio GC-MS^8,9,10.

Las técnicas de extracción sin solventes son muy efectivas para analizar compuestos pequeños y altamente volátiles (que de lo contrario se pueden perder fácilmente de una muestra) porque estos métodos inmovilizan los compuestos en un soporte de fase estable y sólido. El HS-SPME utiliza una fibra recubierta con un polímero adsorbente para capturar compuestos volátiles en el espacio de la cabeza de la muestra o para extraer compuestos disueltos por inmersión en un fluido biológico acuoso¹¹. La capa del polímero no ata los compuestos fuertemente, por lo tanto calentando en el puerto de la inyección de la CROMATOGRAFÍA GASEOSA pueden ser quitados. Este método es más potente que las técnicas de extracción con disolventes y también más eficaz que el DHS.

En el enfoque actual, las muestras están contenidas dentro de viales de vidrio. Estos viales se calientan a una temperatura de 40 °C para simular la temperatura corporal del animal con el fin de promover que los componentes volátiles de la marca de olor ocupen el espacio de la cabeza del vial. Una fibra SPME, recubierta con 65 μm de material sorbente de polidimetilsiloxano/divinilbenceno (PDMS/DVB), se expone al entorno del espacio de la cabeza y los componentes volátiles de la muestra se adsorben en la fibra. Al calentar la fibra en el puerto de entrada de un GC-MS, los componentes volátiles se desorben de la fibra y luego se separan por el GC. Los patrones de fragmentación espectral de masa se obtienen para cada componente utilizando la EM. Mediante la comparación de estos espectros de masas con las bases de datos espectrales de masas, puede ser posible identificar tentativamente los componentes de la marca de olor. A través del uso de un auto-muestreador, somos capaces de analizar múltiples muestras en lotes de una manera consistente.

Dado que cada tipo de fibra SPME tiene una afinidad diferente con los productos químicos polares, la fibra generalmente se elige dependiendo de la polaridad y / o peso molecular de los compuestos químicos objetivo. Además, las condiciones de GC se cambian dependiendo del tipo de columna gc y las características de los compuestos químicos objetivo.

Esta técnica permite el análisis semicuantitativo de los componentes volátiles de las marcas de olores al permitir la separación e identificación tentativa de los componentes en la muestra, seguida del análisis de las relaciones de área de pico para buscar tendencias que podrían significar componentes de la marca de olores que pueden estar involucrados en la señalización.

Los puntos fuertes clave de este enfoque actual son:

• El rango de tipos de muestra que se pueden analizar.
• No se requiere preparación de muestras complejas ni extracciones.
• La capacidad de analizar componentes volátiles.
• La capacidad de separar los componentes de una mezcla.
• Poder identificar los componentes detectados.
• La capacidad de proporcionar información semicuantitativa y potencialmente cuantitativa sobre los componentes detectados.