Kardiyak Hedefleme Peptidin Transdüksiyon Verimlerinin Vivo Görüntülemesinde
Summary
Eksvivo görüntüleme sistemlerini kullanan hücre penetran peptidler ile transdüksiyon derecesini değerlendirmek için protokolleri, parafin katıştırma, kesitleme ve konfokal floresan mikroskopisi kalp hedefleme peptidini örnek olarak kullanarak açıklıyoruz. Protokolümüzde, tek bir hayvan aynı organların her iki tür de görüntüleme değerlendirmesini elde etmek için kullanılabilir ve bu da çalışmalar için gerekli hayvan sayısını yarı yarıya azaltabilir.
Abstract
Protein transdüksiyon etki alanlarının ilk açıklamasından bu yana, hücre delici peptidler olarak da bilinen, 25 yıl önce, tanı ve tedavi edici malzemelerin teslimi için yeni vektörler olarak bu peptidlerin, özellikle de hücreye özgü olanların geliştirilmesine yoğun ilgi olmuştur. Faj taraması içeren geçmiş çalışmamızda, intravenöz enjeksiyondan sonra 15 dakika gibi kısa bir sürede görülen pik alımı ile normal kalp dokusunu invivo olarak aktarabilme yeteneği nedeniyle kardiyak hedefleme peptid (CTP) adını verdiğimiz 12 amino asit uzunluğunda bir peptid tanımlanmıştır. Florofor siyanür5.5 etiketli CTP enjekte ederek, çeşitli süreler boyunca dolaşmasına izin vererek ve floresan mikroskopi görüntülemenin ardından birden fazla organın ötenazi, sabitlenmesi ve kesitlenmesi ile detaylı biyodağıtım çalışmaları yaptık. Bu yayında, in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak hasat edilen organların ex vivo görüntülemesinin yanı sıra bu süreçleri de ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Örnek olarak CTP kullanarak transdüksiyon ve biyodağıtım çalışmaları nın üstlenilen ayrıntılı metodolojiler ve uygulamalar sayılmaktadır.
Introduction
Hücre plazma membranı hücre bütünlüğü ve hayatta kalma için gerekli olan yarı geçirbilebilir bir bariyerdir ve hücre içine maddelerin hareketini kontrol ederek hücrenin iç düzenlemek için hizmet vermektedir. Hayatta kalmak için hayati olmasına rağmen, aynı zamanda hücreye kargo teslimi için bir engel sunuyor. 1988 yılında, transkripsiyon trans-aktivatör (Tat) protein insan immün yetmezlik virüsü kültürlü hücrelere girmek ve viral gen ekspresyonu teşvik gösterilmiştir1,2, etki alanları bu transdüksiyon için üçüncü helix sınırlı ve lizin zengin 13-amino asit bölgesi ile sınırlı olan bu böylece hücre peptidler (CPPs) olarak adlandırılmıştır.3 Bunu, Tat peptidin fonksiyonel β-galaktosidazı birden fazla hücretipinetaşıma yeteneğini gösteren araştırmalar izledi 4 . İlk tanımdan bu yana, hücre delici peptidlerin sayısı önemli ölçüde artmıştır. Bu transdüksiyon etki alanları doğal olarak meydana gelen veya sentetik kısa peptidler, genellikle 6−20 amino asitler uzunluğunda, hücre zarları arasında fonksiyonel yükleri taşımak edebiliyoruz. Bu yükler diğer küçük peptidler, tam uzunlukta proteinler, nükleik asitler, nano tanecikleri, viral parçacıklar, floresan moleküller ve radyoizotoplar5arasında değişebilir. Açıklanan ilk KPS hücre spesifik değildi, Tat birden fazla hücre tipleri tarafından alınan ve hatta kan-beyin bariyerini geçerek4, dolayısıyla tedavi potansiyelini sınırlayan. Hücreye özgü CpPs belirlemek için, araştırmacılar büyük kullanarak faj ekran üstlenilen var, ticari olarak kullanılabilir faj kütüphaneleri6. Bir kombinatoryal in vitro ve in vivo faj görüntüleme metodolojisi kullanarak kendi çalışmamız kardiyak hedefleme peptid (CTP)7adlı bir CPP belirlenmesine yol açtı , 12-amino asit, doğal olmayan oluşan peptid (NH2-APWHLSSQYSRT-COOH) bir periferik intravenöz enjeksiyon 8 sonra pik alımı ile kalbi hedefleyen8. Aktin ile immünfloresan kolokalizasyon kullanarak, hücre içi belirteç, ve lamina hariç, bir hücre zarı belirteci, biz CTP bir intravenöz enjeksiyon sonra fare kardiyomiyosit içine internalize olduğunu gösterdi7. Ayrıca, insan indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı dayak kardiyomiyositler çift etiketli CTP ile, onun C-terminus ve rhodamine onun N-terminus sadece hücre içi ester ester esterases tarafından yarıdan olabilir bir ester bağlantı ile etiketli. Konfokal mikroskopide 15 dk içinde kardiyomiyositlere rhodamine hızlı birikimi gözlendi8.
Bu makalede, biyodağılımı izlemek ve CTP kullanarak KPP’lerin dokuya özgü içselleşmesini onaylamak için kullanılabilecek iki ücretsiz metodoloji sayılmaktadır. Bu metodolojiler için CTP sentezlendi, floresan olarak N-terminus’ta siyanür5.5 (CY5.5) ile etiketlendi ve daha fazla peptit stabilitesi için C-terminusta amid-kapaklı. Kullanılan iki metodoloji in vivo floresan optik görüntüleme sistemleri ve doku kesitlerinin floresan mikroskobu. Her iki yöntem de biyodağıtım, alım ve floresan etiketli CpPs ortadan kaldırılması çalışmalarında çok yararlıdır. Tek foton emisyon tomografisi (SPECT) veya pozitron emisyon tomografisi (PET) gibi bu yöntemlerle biyodağılımı değerlendirmenin avantajı, tüm peptit sentez tesislerinde nispeten kolay ve rutin kullanımda olan floresan etiketleme ile karşılaştırıldığında CpP’lerin zaman yoğun radyolabeling’ine gerek olmamasıdır. In vivo görüntülemekullanımı hızlı bir şekilde yaşayan bir sistem bağlamında biyodağıtım verileri üretirken, kesit, morfolojik detayların korunması yoluyla hücrelerdeki peptit alımı ve lokalizasyonu hakkında daha ayrıntılı bilgi sağlar. Bu protokol kalp, akciğer, karaciğer, böbrek, beyin, dalak, mide, kalın bağırsak, ince bağırsak, iskelet kası, kemik, testisler/yumurtalıklar ve gözler gibi çok çeşitli organ ve dokulara uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hayvan modelleri, yeni KP’lerin tanımlanmasından, biyodağıtım çalışmalarından, transdüksiyon mekanizmasından, bu yeni CpP’leri vektör olarak kullanarak teslim edilen kargonun etkinliğini test etmeye kadar sürecin her aşamasında klinik öncesi ilaç gelişimi için gereklidir. Histoloji, nükleer tıp görüntüleme (SPECT ve PET) ve in vivo optik görüntüleme12gibi biyodağıtımı değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan birçok yöntem vardır. Nükleer görüntüleme yöntemleri küçük hayvan SPECT ve PET sistemlerinin sınırlı kullanılabilirliği nedeniyle hantal olabilir, yanı sıra radyokimyacı uzmanlık gerektiren radiolabel-ilaç konjugeler üretmek için yeteneği. Buna karşılık, floresan etiketler çok daha basittir ve çalışmak için maliyet etkin olabilir. Bu yazıda açıklanan protokol, birden fazla yöntem kullanılarak biyodağılımın hızlı analizini sağlar. Ex vivo tüm organ floresan optik görüntüleme farklı doku lar ve tedavi grupları arasında floresan hemen karşılaştırma sağlar ve yarı kantitatif bir şekilde ilgi organında alımı pik organ alımını ve zaman belirleyebilirsiniz. Kantitatif doku histolojisi dokuların tedavisi, kesiti, görüntülenmesi ve analiz iúlenmesi için daha kapsamlı bir işleme gerektirir, ancak mikroskobik düzeyde daha fazla veri sağlar ve güncel bir standart tekniktir. Farklı organlar ve uyarma dalga boyları için her teknikte görülen otofloresans önemli ölçüde değiştiğinden, iki teknik arasında doğrudan, nicel karşılaştırmanın mümkün olmadığını belirtmekte değerlidir.
Bu protokolün önemli bir bölümü, denemeiçin aday CpPs etiketlemek için doğru florofor seçmektir. Bir potansiyel sorun birden fazla florofor gerektiğinde sorunlu olabilir spektrum örtüşmesi vardır. DAPI floresan montaj ortamı ve Cy5.5 örtüşen spektrumları yok. Ancak, birden fazla floroforgereklinin gerekli olduğu bazı uygulamalarda spektral çakışma riskinin dikkatle değerlendirilmesi gerekmektedir. Kullanılan sisteme bağlı olarak florofor seçimi sınırlı olabilir. Bu nedenle, sistemin yetenekleri hakkında bilgi önemlidir. Floresan optik sistemler en iyi kısa dalga boylarının yüksek doku emilimi nedeniyle uzak kırmızı veya yakın kızılötesi floropores ile kullanılmaktadır13. Gelişmiş yeşil floresan protein aralığında floresan önemli bir sınırlama var, onun uyarma dalga boyunda görülen önemli organ otofloresans çünkü, özellikle beyin ve karaciğer dokusunda. Bir deneyin koşullarına bağlı olarak, bazı floroforlar en iyi kaçınılmalıdır. Bazı suda çözünen organik floroforlar lipid iki katları ile güçlü bir etkileşime sahiptir, hangi yanlış pozitif neden olabilir. Bu nedenle, bir florofor ilgi dokusuna güçlü bir yakınlık olup olmadığını belirlemek için adımlar atılması tavsiye edilir14. Göz önünde bulundurulması gereken bir diğer faktör de sonuçları etkileyen önemli bir parametre olabilecek uygun florofor çekimi yöntemini seçmektir. CpPs n floresan olarak etiketlenebilir- veya C-terminus peptid N-terminus ve Cy5.5-NHS gibi boya karboksil grubu arasında kovalent bir bağ yoluyla. Çoğu KPS’nin transdüksiyon mekanizması ayrıntılı olarak anlaşılamadığından ve bir uçtaki çekim alım mekanizmasını diğer uca göre daha çok etkileyebileceğinden, özen izlenmelidir. CpPs etiketleme için başka bir olasılık floresan streptavidin etiketli konjugasyon için N-terminus biotinylating yoluyla. Bu stratejiyi kullanarak farklı floresan streptavidin conjugates kullanılmasına izin kolaylığı vardır. Ancak, bu stratejinin olası bir sınırlama bir biotin-streptavidin kompleksi potansiyel transdüksiyon engel olabilir büyük bir yapı olmasıdır.
Floresan optik görüntüleme sistemleri, farklı organlar ve tedaviler arasında floresan karşılaştırması verimli bir şekilde oluşturmak için etkili bir stratejidir, ancak dokudaki mutlak konsantrasyonların nicel bir ölçüsünü üretememektedir. Bu doku içinde ışık saçılma etkileri nedeniyle, hangi daha fazla doku boyutları ve yoğunlukları doğal olarak oluşan çeşitli ile bileşik, ve vaskülarite farklılıkları, değişken floresan saçılma ile. Doku otofloresans da bir faktör olabilir, kollajen gibi doğal olarak oluşan biyokimyasal kaynaklar nedeniyle, ya da gıda klorofil gibi diyet kaynakları13.
Histoloji biyodağılımı ölçmenin en yaygın kullanılan yöntemidir ve zaman içinde farklı dokular arasında alımını doğru bir şekilde ölçmek ve karşılaştırmak için kullanılabilir. Tüm dokular aynı kalınlığa15kesitli olduğundan ışık saçılma sorunları bu yöntem kullanılarak önlenir. Bu yöntemin en önemli avantajı immünohistokimya için ek floresan etiketler postsectioning dahil yeteneğidir. Başka bir florofor eklenmesi görüntülemeyi daha zor hale getirse de, floresan etiketlerin kullanımı, lysosomes veya mitokondri gibi belirli hücre içi bölmelere CPP lokalizasyonu için yararlı olabilir. Bir antikor bir konfokal mikroskopi deneyinde transeksif bir aday CPP’nin bir araştırma yapısıyla bir araya olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir, bu da bir Dağıtım maddesi olarak Bir CPP’nin potansiyelini gösterebilir. Bu yöntemin bir sınırlama organ örneklerinden slaytlar hazırlanması zaman alıcı olabilir, emek yoğun, ve insan hatasına eğilimli12,15. Görüntü slaytları, photobleaching önlemek için çok uzun süre aynı konumu görüntü değil dikkatli olmalıdır. Florofor hassasiyetine bağlı olarak bazı fotobeyazrlama kaçınılmaz olacaktır. Örneklerin ortam ışığından korunması ve düzgün bir şekilde sakkorunmasına özen16. Slaytların ileride görüntüleme için ışık korumalı olarak 4 °C’de saklanmalarını öneririz.
Daha karmaşık CPP etiketleme gerektirebilir rağmen, özel ekipman gerektiren ve karşılaştırılabilir sonuçlar üretebilir bir aday CPP biyodağıtım ölçmek için çeşitli yöntemler vardır. Bu yazıda açıklanan protokol, aynı örnekten hücrelerdeki peptit içselleştirmesi hakkında daha derinlemesine bilgi edinimi sağlarken, yaşam sistemi bağlamında biyodağıtım verilerini verimli bir şekilde üretmek için iki uyumlu yöntem kullanır ve böylece bir çalışma için gerekli olan hayvan sayısını yarı yarıya azaltmaktadır. Bu yöntemler, her iki yöntemin de aynı hayvanda sırayla kullanılabileceğini ve her biri tarafından oluşturulan verilerin kalitesini gösteren yukarıdaki verileri oluşturmak için kullanılmıştır. Sonuçlarımız ayrıca, iki teknik arasındaki sonuçları nicel bir şekilde doğrudan ilişkilendirememenin de altını çizmektedir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.Z. ve K.S.F. Amerikan Kalp Derneği Bilim Adamı Geliştirme Ödülü 17SDG334111180 tarafından desteklenir ve Pittsburgh Üniversitesi Klinik ve Çeviri Bilim Enstitüsü aracılığıyla Pitt Innovation Challenge (PInCh®) altında verilen bir hibe ile desteklenir.
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | ThermoFisher | SF100-4 | |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | ThermoFisher | BP2471-1 | |
| 12-well Cell Culture Plate | ThermoFisher | 353043 | |
| 1x TBS Solution | 10x TBS is diluted 1:10 with deionized water. This solution can be stored at room temperature. | ||
| 20 mL Scintillation Vials | Wheaton | 334173 | |
| 26G Needles | Becton Dickinson | 305110 | |
| 28G 0.5ml Insulin syringes | Becton Dickinson | 329461 | |
| 3mL Syringe | Becton Dickinson | 309657 | |
| CD1 Mice | Charles River | 022 | 6 to 12 week old albino, female mice |
| Cover Glass | ThermoFisher | 12-544-14 | |
| Cy5.5-CTP-amide | Prepared by peptide synthesis, conjugated with Cy5.5 fluorophore, and purified using HPLC. Lyophilized powder is reconstituted in DMSO at 10mM concentration. After reconstituting, store at -80 °C. | ||
| Dapi Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 99150-20 | |
| Ethanol | |||
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Ketamine HCl 100mg/mL | KetaVed | NDC 50989-161-06 | |
| Ketamine/Xylazine Solution | Ketamine HCl is mixed with Xylazine 1:1 to produce a stock solution containing 50mg/mL ketamine and 10mg/mL Xylazine. This solution is made fresh before each use. | ||
| Leica RM2235 Rotary Microtome | Leica | RM2235 | |
| Microscope Slides | ThermoFisher | B9992000TN | |
| Paraplast X-TRA | Sigma | P3808-1KG | |
| Perkin Elmer Lumina S5 IVIS | Perkin Elmer | CLS148588 | |
| Sparkle Optical Lens Cleaner | ThermoFisher | NC0090079 | |
| Tissue-Tek Processing/Embedding Cassettes | ThermoFisher | NC9499605 | |
| Tissue-Tek VIP Processing machine | Tissue-Tek | VIP 5A-F1 | |
| Xylazine 20 mg/mL | AnaSed | NDC 59399-110-20 | |
| Xylenes | ThermoFisher | X5-4 |
References
- Green, M., Loewenstein, P. M. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein. Cell. 55 (6), 1179-1188 (1988).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55 (6), 1189-1193 (1988).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Cell-type specific penetrating peptides: therapeutic promises and challenges. Molecules. 20 (7), 13055-13070 (2015).
- Zahid, M., Robbins, P. D. Identification and characterization of tissue-specific protein transduction domains using peptide phage display. Methods in Molecular Biology. 683, 277-289 (2011).
- Zahid, M., et al. Identification of a cardiac specific protein transduction domain by in vivo biopanning using a M13 phage peptide display library in mice. PLoS One. 5 (8), e12252 (2010).
- Zahid, M., et al. Cardiac Targeting Peptide, a Novel Cardiac Vector: Studies in Bio-Distribution, Imaging Application, and Mechanism of Transduction. Biomolecules. 8 (4), E147 (2018).
- Amblard, M., Fehrentz, J. A., Martinez, J., Subra, G. Methods and protocols of modern solid phase Peptide synthesis. Molecular Biotechnology. 33 (3), 239-254 (2006).
- Katritzky, A. R., Yoshioka, M., Narindoshvili, T., Chung, A., Johnson, J. V. Fluorescent labeling of peptides on solid phase. Organic and Biomolecular Chemistry. 6 (24), 4582-4586 (2008).
- Prabhala, B. K., Mirza, O., Hojrup, P., Hansen, P. R. Characterization of Synthetic Peptides by Mass Spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1348, 77-82 (2015).
- Arms, L., et al. Advantages and Limitations of Current Techniques for Analyzing the Biodistribution of Nanoparticles. Frontiers in Pharmacology. 9, 802 (2018).
- Leblond, F., Davis, S. C., Valdes, P. A., Pogue, B. W. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. Journal of Photochemistry and Photobiology. 98 (1), 77-94 (2010).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose your label wisely: water-soluble fluorophores often interact with lipid bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
- McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
